盾殼霉產生真菌物質的調控及其分子機理研究.pdf

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌,在世界范圍內廣泛分布,在菌核病的生物防治中有著非常重要的作用。本論文主要針對碳源,氮源和環(huán)境pH對盾殼霉產生抗真菌物質(AFS)的調控及其分子機理進行了研究。
　　 研究發(fā)現盾殼霉菌株Chy-1在改良的查比培養(yǎng)基(MCD)中培養(yǎng)時能穩(wěn)定產生AFS；而在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中培養(yǎng)時卻不能產生AF

2、S。為了進一步研究盾殼霉在MCD和PDB培養(yǎng)液中生長時產生AFS的差異,研究了營養(yǎng)和環(huán)境pH值對盾殼霉產生AFS的影響。結果顯示:盾殼霉培養(yǎng)物濾液對核盤菌菌絲生長的抑制率與環(huán)境pH值相關,較適宜盾殼霉產生AFS的碳源或氮源,其培養(yǎng)液的環(huán)境pH值都較低。當盾殼霉在環(huán)境pH值緩沖為3的培養(yǎng)液中生長時,培養(yǎng)濾液對核盤菌菌絲生長的抑制率遠遠高于當環(huán)境pH值緩沖為6的培養(yǎng)液。
　　 為了研究環(huán)境pH值調控盾殼霉產生抗真菌物質的分子機理,本

3、文用簡并引物和RACE技術從盾殼霉菌株Chy-1中克隆到了pH感應轉錄調控因子基因(cmpacC)和碳代謝抑制因子基因(cmcreA)。cmpacC的全長序列(GenBank Acc.No.FJ176399)含有一個開放閱讀框和兩個內含子。根據cmpacC的堿基序列推測cmpacC編碼一個長度為596個氨基酸殘基的蛋白質(GenBank Acc.No.ACN43303),其含有三個保守的鋅指結構域。同時本文也用基因組步移的方法克隆到了長

4、度為2740bp的cmpacC5’端側翼序列及長度為2730bp的cmpacC3’端側翼序列。其中,5’端側翼序列含有5個PacC結合位點(5’-GCCAAG-3’)和三個CreA結合位點(5'-SYGGRG-3')。確定了cmpacC轉錄時的加A位點。熒光定量RT-PCR的分析結果顯示:當盾殼霉在不同環(huán)境pH條件下生長時,cmpacC、幾丁質酶基因(cmch1)和β1,3-葡聚糖酶基因(cmg1)的表達量都隨著環(huán)境pH值的上升而升高。

5、當盾殼霉在以單糖為碳源的培養(yǎng)基中生長時,cmcreA基因的表達量低,而當碳源為微生物不易利用的多糖時,cmcreA的相對表達量高。利用農桿菌介導同源重組的方法對盾殼霉中cmpalF基因進行了敲除。結果顯示:當cmpalF基因缺失后,cmpacC的表達量降低,在環(huán)境pH高于6的環(huán)境中生長速度顯著低于野生型菌株。在緩沖環(huán)境pH值為6時,培養(yǎng)濾液對核盤菌菌絲生長的抑制率顯著高于野生型菌株。
　　 用數字化表達譜技術分析了盾殼霉菌株Ch