高脂肥胖對腸道微生態(tài)、短鏈脂肪酸的影響.pdf

1、目的：
　　腸道作為機體最大的消化器官，其中定居著大量的微生物群落，參與對物質(zhì)的消化與吸收，并且其發(fā)酵的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（ short-chain fatty acids, SCFAs）在維持腸道健康和正常功能的行駛方面起著至關重要的作用。腸上皮細胞（intestinal epithelial cells, IECs）為腸道的第一道保護屏障，與腸道內(nèi)環(huán)境直接接觸。本實驗研究了在肥胖情況下腸道中微生物群落及其代謝產(chǎn)物 SCFAs的

2、變化情況，并探討這種變化因素對腸上皮細胞的影響。
　　方法：
　　（1）為研究肥胖情況下，腸道中微生物群落的變化情況，將適齡 C57BL/6小鼠分為肥胖組（HFD）與正常組（LFD,6周后，分別取其腸道內(nèi)容物。通過Miseq高通量測序技術(shù)分別對腸道中微生物群落進行檢測和鑒定，確定腸道微生態(tài)的變化。
　?。?）為建立快速檢測糞便中SCFAs的方法，并確定此種檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。分別取不同種屬來源的糞便，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（

3、Gas chromatography mass spectrometry， GC-MS）方法分別檢測糞便中SCFAs，探究在生理狀態(tài)下，糞便中SCFAs的存在形式，并確定GC-MS方法的可行性和穩(wěn)定性。
　?。?）取上述肥胖小鼠及正常對照小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，通過GC-MS的方法測定其中SCFAs的含量，探究在肥胖情況下，糞便中SCFAs的變化趨勢。
　　（4）為研究在腸道疾病如腸炎情況下，糞便中SCFAs的存在方式，將適齡C57

4、BL/6小鼠分為腸炎組（DSS）和正常組（NC），7天后，分別取其腸道內(nèi)容物，GC-MS測定糞便中SCFAs含量，確定在腸炎狀態(tài)下，糞便中SCFAs的變化情況。
　?。?）體外試驗中，為研究丁酸對腸上皮細胞的影響，將腸上皮細胞SW48細分為6中處理組，分別為正常組（NC）、LPS處理組（LPS）、丁酸處組（BU）、丁酸-LPS共同處理組（BU+LPS）、TSA處理組（TSA）、TSA-LPS共同處理組（TSA+LPS），觀察丁酸、

5、TSA對細胞生長狀態(tài)的影響，通過CCK-8探究細胞的增殖能力，并通過流式、western blot及定量測定其細胞表面TLR4的表達情況，再以不同濃度丁酸和TSA處理細胞，確定不同濃度下的丁酸及TSA對細胞表面TLR4表達的影響。為確定丁酸對TLR4下游信號通路的影響，western blot檢測上述6種處理組中下游信號通路中各種信號分子的表達情況。
　　結(jié)果：
　?。?）通過Miseq測序技術(shù)檢測細菌16s rRNA結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)，與正常對照組相比較，肥胖小鼠腸道中微生物豐富度及多樣性下降并且 S24-7及擬桿狀菌屬數(shù)量明顯減少，但脫硫弧菌屬增多。
　?。?）GC-MS檢測正常C57BL/6小鼠結(jié)腸內(nèi)容物及新鮮糞便、SD大鼠糞便及健康成人糞便中SCFAs結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，糞便中SCFAs以乙酸、丙酸、丁酸及戊酸為主，就其含量而言，乙酸含量最多，丁酸、丙酸次之，戊酸含量相對較低，并且在不同的哺乳動物糞便中，各種 SCFAs有相似的存在形式。
　

7、?。?）通過 GC-MS對肥胖小鼠糞便中SCFAs檢測發(fā)現(xiàn)，在肥胖情況下，各種SCFAs都有不同程度的下降，其中丁酸下降較為明顯。
　?。?）肥胖為誘發(fā)腸炎的一個影響因素，通過GC-MS測定腸炎小鼠糞便中SCF As的變化情況，結(jié)果表明，在腸炎情況下，糞便中SCFAs的變化與在肥胖情況下的變化趨勢相似，除乙酸外的丙酸、丁酸及戊酸含量都發(fā)生了明顯的下降，其中以丁酸含量下降尤為明顯。
　?。?）體外實驗中，以丁酸及TSA處理腸上

8、皮細胞發(fā)現(xiàn)，丁酸及TSA處理后的細胞生長狀態(tài)較差并且對細胞增殖起抑制作用，這種抑制作用具有濃度依賴效應。流式、western blot及定量檢測細胞表面TLR4發(fā)現(xiàn)，丁酸及TSA處理后會上調(diào)細胞表面TLR4的表達，而降低處理濃度后這種上調(diào)作用依然存在。
　　結(jié)論：
　?。?）通過Miseq高通量測序技術(shù)對腸道內(nèi)微生物群落的檢測及鑒定發(fā)現(xiàn)，當肥胖發(fā)生時，腸道內(nèi)微生態(tài)，與正常情況比較，發(fā)生了明顯的變化。
　?。?）GC-M