炭疽芽胞桿菌sigF基因功能的研究.pdf

1、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)簡(jiǎn)稱炭疽桿菌，是一種能通過(guò)形成芽胞感染人畜導(dǎo)致炭疽病的病原體。感染途徑包括皮膚炭疽、腸炭疽和肺炭疽。由于芽胞具有良好的抗逆性，且易于制備，炭疽芽胞可能會(huì)被制造成生物戰(zhàn)劑或用于生物恐怖襲擊。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和研究，炭疽桿菌中的sigma因子是RNA聚合酶的組成部分，參與芽胞形成和細(xì)菌抗逆性的調(diào)控。
　　本課題以炭疽桿菌A16D2為實(shí)驗(yàn)菌株，利用同源重組的方法構(gòu)建了A16D2的sigF的

2、缺失株和回復(fù)株并進(jìn)行了核酸和蛋白水平的驗(yàn)證。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線及糖代謝實(shí)驗(yàn)、芽胞染色、微流控觀察細(xì)胞、電鏡觀察、抗逆性實(shí)驗(yàn)及雙向電泳實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜鑒定，比較出發(fā)菌株和缺失株的差別，研究了sigF基因的功能，為炭疽桿菌減毒、炭疽疫苗的研發(fā)等后續(xù)工作具有一定的參考和借鑒意義。
　　1.缺失株和回復(fù)株的構(gòu)建
　　本研究以改造過(guò)的大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pKMU7為載體，利用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后的Golden Gate方法構(gòu)建打靶載體，并

3、將載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入A16D2中，通過(guò)抗性篩選出缺失株A16D2△sigF::spc。構(gòu)建回復(fù)株質(zhì)粒pBE2-psigF，采用電轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入缺失株A16D2△sigF::spc的感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)抗性篩選出回復(fù)株。
　　2.出發(fā)菌株、缺失株和回復(fù)株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定和糖代謝實(shí)驗(yàn)
　　A16D2、A16D2△sigF::spc和RA16D2△sigF::spc的生長(zhǎng)速率沒(méi)有顯著差異。糖代謝實(shí)驗(yàn)顯示A16D2和A16D2△

4、sigF::spc均利用了核糖、果糖、葡萄糖、檸檬酸、乙?；咸烟?、麥芽糖、蔗糖和海藻糖等碳水化合物。在24h和48h的觀察后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)菌株對(duì)糖的利用能力沒(méi)有差異，說(shuō)明sigF基因不參與糖代謝的調(diào)控。
　　3.出發(fā)菌株、缺失株和回復(fù)株的芽胞形成實(shí)驗(yàn)
　　經(jīng)過(guò)芽胞復(fù)紅-美藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)A16D2形成了芽胞而A16D2△sigF::spc不能形成芽胞，部分RA16D2△sigF::spc回復(fù)了形成了芽胞的表型，說(shuō)明是sigF的缺失

5、導(dǎo)致細(xì)胞不能形成芽胞。進(jìn)一步進(jìn)行微流控培養(yǎng)實(shí)時(shí)觀察和電鏡觀察實(shí)驗(yàn)顯示， A16D2△sigF::spc菌株則主要表現(xiàn)為停留在不對(duì)稱分裂狀態(tài)的繁殖體階段，說(shuō)明sigF的缺失影響了炭疽不對(duì)稱分裂過(guò)程。
　　4.出發(fā)菌株、缺失株和回復(fù)株的抗逆性實(shí)驗(yàn)
　　分別利用過(guò)氧化氫、乙醇和高溫處理三個(gè)菌株。在過(guò)氧化氫處理的實(shí)驗(yàn)中， A16D2△sigF::spc對(duì)過(guò)氧化氫比較敏感，A16D2和RA16D2△sigF::spc的抗過(guò)氧化氫的能力

6、較強(qiáng)，說(shuō)明sigF與抗過(guò)氧化物的能力有關(guān)。在乙醇處理的實(shí)驗(yàn)中， A16D2△sigF::spc對(duì)乙醇比較敏感，而A16D2和RA16D2△sigF::spc抗乙醇的能力較強(qiáng)，說(shuō)明sigF與分解乙醇的能力有關(guān)。
　　在高溫處理的實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)菌株沒(méi)有明顯差異。
　　5.比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　制備13h的出發(fā)菌株和缺失株的全菌蛋白樣品，進(jìn)行雙向電泳，通過(guò)比較分析，共鑒定到10個(gè)明顯的差異點(diǎn)，代表10個(gè)蛋白。通過(guò)對(duì)這些蛋白點(diǎn)