免疫活性地龍肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　地龍又名蚯蚓、蛐蟮，是我國(guó)最寶貴的傳統(tǒng)中藥材之一，已有4000余年的入藥歷史。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作得到一含有七條帶組分，分子量在20KD以下，具有免疫調(diào)節(jié)作用的地龍肽，并命名為免疫活性地龍肽（Dilong immuno-activepeptides，DIAP），在一定濃度范圍內(nèi)可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，提高NK細(xì)胞殺傷率;并與IL-2具有協(xié)同作用;還可以拮抗環(huán)磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用，且濃度越大作用越強(qiáng);在低濃

2、度時(shí)（0.1-10μg/ml）亦可活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬功能。選用丙酮沉淀和DEAE SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析、Sephadex30 pg凝膠過(guò)濾層析，得到一分子量約為10.764KD不含糖成分的組份。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE小分子肽電泳及銀染法測(cè)定顯示其僅有一條帶。
　　因地龍的蛋白提取物具有來(lái)源廣泛、不易引起基因突變、不良反應(yīng)少、生物活性較強(qiáng)、治療費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步研究地龍肽免疫調(diào)

3、節(jié)作用，將其研發(fā)為一種新型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，必將在抗腫瘤及免疫相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮重大作用。
　　本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槊鞔_DEAE SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析分離純化低分子量地龍肽活性組分的最適條件，確定免疫活性地龍肽體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞功能影響的具體環(huán)節(jié)，為其今后的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.地龍為正蚓科愛(ài)勝屬赤子愛(ài)勝蚓;DEASepharoseTM Fast Flow凝膠、Sup

4、erdexTM30pg凝膠由GE Healthcare Bio-Sciencer AB生產(chǎn);人淋巴細(xì)胞分離液由Sigma公司生產(chǎn);新鮮羊靜脈血。
　　2.免疫活性地龍肽分離和純化:分為地龍肽的粗分離、超濾、丙酮沉淀、DEAE SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析、SuperdexTM30 prep grade凝膠過(guò)濾層析四個(gè)部分。
　　3.蛋白含量測(cè)定:采用Folin-酚試劑法（Lowry法）測(cè)定，以BS

5、A為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
　　4.免疫活性地龍肽分子量測(cè)定:采用Tricine-SDS-PAGE小分子肽電泳及銀染法測(cè)定。
　　5.免疫活性地龍肽活性測(cè)定:采用國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂件(XGB2003-001)胸腺肽溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，T細(xì)胞活性測(cè)定——脫E受體法測(cè)定。
　　6.C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞的分離純化:采用美天妮NK cell Isolation KitⅡ陰性分選法。
　　7.免疫活性地龍肽

6、對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞增殖的影響:采用CCK-8法。
　　8.免疫活性地龍肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響:采用CCK-8法。
　　9.免疫活性地龍肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞遷移的影響:采用Transwell小室法。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的值均用(X)±SD來(lái)表示。用SPSS19.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.免疫活性地龍肽的粗分離效果的比較
　　

7、新鮮蚯蚓清洗干凈后，經(jīng)勻漿、反復(fù)凍融、提取、高速離心后收集上清液，選用分子量為100KD、10KD、3KD中空纖維超濾柱進(jìn)行分級(jí)超濾，收集分子量在3～10KD的組分，應(yīng)用2倍體積丙酮沉淀真空冷凍干躁。用Lowry法測(cè)定處理前后溶液蛋白濃度并計(jì)算蛋白回收率。結(jié)果顯示，自然狀態(tài)下，3～10KD的地龍肽組分的含量不足0.1％。
　　2.離子交換層析純化條件的探索
　　用pH8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-

8、Hcl緩沖液，配制地龍肽溶液，研究不同pH值的緩沖液地對(duì)龍肽T活性分離的效果。脫E受體法測(cè)定結(jié)果顯示，隨著Tris-Hcl緩沖液pH值的逐漸升高，E-RFC值亦逐漸升高，在8.8達(dá)到峰值，與1mg/ml胸腺肽活性相當(dāng)，其后下降，所以，我們確定pH8.8的Tris-Hcl緩沖液為DEAE SepharoseTM Fast Flow離子交換層析分離純化免疫活性地龍肽T的最適條件。
　　3.Tricine-SDS-PAGE小分子肽電泳分

9、析地龍肽
　　用Tricine-SDS-PAGE小分子肽電泳法對(duì)免疫活性地龍肽F進(jìn)行分析顯示其為清晰一條帶如圖4所示。通過(guò)繪制蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)擬合公式y(tǒng)=-0.0826x+2.9391R2=0.9743，計(jì)算出地龍肽F的分子量為10.764KD。
　　4.免疫活性地龍肽體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞增殖的影響
　　選用CCK-8法檢測(cè)了胸腺五肽、免疫活性地龍肽T、免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果

10、顯示，隨著胸腺五肽(8、16、32、64、128和256μg/m)、免疫活性地龍肽T（32、64、128和256μg/ml）、免疫活性地龍肽X（16、32、64、128和256μg/ml）濃度的逐漸升高和時(shí)間的增加(24h、48h)，胸腺五肽、免疫活性地龍肽T、免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞促增殖的作用逐漸增強(qiáng)，差異顯著（p＜0.01）;促增殖作用強(qiáng)度依次為胸腺五肽＞免疫活性地龍肽X＞免疫活性地龍肽T。
　　5.免疫活性地龍

11、肽體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性的影響
　　選用CCk-8法檢測(cè)了胸腺五肽、免疫活性地龍肽T、免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性的影響，結(jié)果顯示，胸腺五肽在8、16、32、64、128和256μg/ml濃度范圍內(nèi)，均對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性具用增強(qiáng)作用(p＜0.01）;免疫活性地龍肽X在16、32、64、128和256μg/ml濃度范圍內(nèi)，亦對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性具用增強(qiáng)作用(p＜0.01)，但增強(qiáng)作用低于胸腺五肽;免疫

12、活性地龍肽T在16、32、64、128和256μg/ml濃度范圍內(nèi)，亦對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性具用增強(qiáng)作用（p＜0.01），但增強(qiáng)作用低于免疫活性地龍肽X;促殺傷活性增強(qiáng)作用強(qiáng)度依次為胸腺五肽＞免疫活性地龍肽X＞免疫活性地龍肽T。
　　6.免疫活性地龍肽體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移的影響
　　選用Transwell小室法檢測(cè)了胸腺五肽、免疫活性地龍肽T、免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，胸腺五肽、免疫活性

13、地龍肽T、免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移均有促進(jìn)作用，胸腺五肽在8、16、32、64、128μg/ml濃度范圍內(nèi)，均對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移具用促進(jìn)作用(p＜0.01）;免疫活性地龍肽X在16、32、64、128μg/ml濃度范圍內(nèi)，亦對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用(p＜0.01），但促進(jìn)作用高于胸腺五肽;免疫活性地龍肽T在16、32、64和128μg/ml濃度范圍內(nèi)，亦對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移具用促進(jìn)作用(p＜0.01），但促進(jìn)作

14、用低于免疫活性地龍肽X(p＜0.01)但高于胸腺五肽(p＜0.01），差異顯著（p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、將地龍粗提組分經(jīng)分級(jí)超濾，得到分子量在3～10KD的組分，再經(jīng)(A)KTAPurifier100層析系統(tǒng)進(jìn)行陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，得到分子量約為10.764KD且不含糖成分的單一組分。
　　2、免疫活性地龍肽T和免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠分離純化的脾NK細(xì)胞促增殖作用，隨著濃度的逐漸升高和時(shí)間的

15、增加(24h、48h)，逐漸增強(qiáng)，差異顯著(p＜0.01）。
　　3、免疫活性地龍肽T和免疫活性地龍肽X體外對(duì)小鼠分離純化的脾NK細(xì)胞促殺傷作用，在16、32、64、128和256μg/ml濃度范圍內(nèi)逐漸增強(qiáng)，差異顯著(p＜0.01）。
　　4、免疫活性地龍肽T和免疫活性地龍肽X在16、32、64、128μg/ml濃度范圍內(nèi)，體外對(duì)小鼠分離純化的脾NK細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用，高于胸腺五（p＜0.01），差異顯著(p＜0.01）