絨毛外滋養(yǎng)細胞(EVT)侵襲的表觀遺傳調(diào)控機制研究.pdf

1、“胚胎植入是播種生命之苗，腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移則是扣擊死亡之門”[1]。但是，這兩個截然不同的生理過程，卻在細胞增殖分化、免疫逃逸和侵襲信號轉(zhuǎn)導等諸多方面有著驚人的相似之處。胚胎的成功植入需要胚胎絨毛外滋養(yǎng)細胞(extrayillous trophoblast，EVTs)發(fā)揮類似腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的特性，即識別、黏附并降解細胞外基質(zhì)，侵入血管內(nèi)皮，從而使母體血管重建，開啟胎盤的血液供應(yīng)。EVT侵襲與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的根本不同是前者受到嚴格的時空調(diào)控，表現(xiàn)

2、為“有控性侵襲”，后者則表現(xiàn)為“無控性侵襲”[2]。EVT侵襲異常，可引起一系列的妊娠相關(guān)疾病：過度侵入可致絨毛膜癌，侵入過淺與自然流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、先兆子癇等疾病的發(fā)生相關(guān)。然而，迄今為止人們對遺傳水平的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及激素等調(diào)控因素的研究遠未能闡明EVT對子宮內(nèi)膜的“有控性侵襲”機制。
　　目前，調(diào)控滋養(yǎng)細胞分化和發(fā)育的表觀遺傳學研究已成為滋養(yǎng)細胞研究領(lǐng)域的熱點并取得較多成果[3]，但滋養(yǎng)細胞侵襲過程的表觀遺傳學研究依舊存

3、在很多空白。究竟還有哪些基因受到表觀修飾調(diào)控參與了滋養(yǎng)細胞的侵襲過程，調(diào)控表觀修飾過程的關(guān)鍵酶，如：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferasos，DNMTs)等在滋養(yǎng)細胞侵襲中作用如何，目前均知之甚少。本研究以此為出發(fā)點，從表觀遺傳角度，探索DNMTS表達和DNA甲基化修飾在滋養(yǎng)細胞侵襲中的調(diào)控作用，實驗獲得了如下結(jié)果：
　　1.免疫組織化學實驗分析不同DNMTs在不同分化類型滋養(yǎng)細胞中的表達分布，結(jié)果顯示：正常

4、胚胎絨毛中DNMT1在合體滋養(yǎng)細胞(STBs)中度表達，細胞滋養(yǎng)細胞(CTBs)低表達；DNMT3A在STBs低表達，CTBs高度表達；DNMT3B在STBs中度表達，CTBs中低表達。分化和侵襲行為均異常的完全型葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)組織，DNMT1在STBs高度表達，CTBs中度表達。DNMT3A在STBs和CTBs均為中度表達；DNMT3B在STBs高度表達，CTBs中度表達。統(tǒng)計分

5、析顯示，在正常胚胎絨毛中，DNMT1在STBs的表達較CTBs中高，但無顯著性差異(P=0.12)；DNMT3A在STBs中的表達遠低于其在CTBs的表達，差別具有顯著意義(P<0.01)；DNMT3B在STBs的表達較CTBs中高，但無顯著性差異(P=0.23)。與正常胚胎絨毛相比：DNMT1(P<0.01)和DNMT3B(P<0.05)在完全型葡萄胎的STBs表達顯著上調(diào)，DNMT3A表達下調(diào)，無顯著性意義(P=0.21)；CTBs

6、中DNMT1和DNMT3B表達上調(diào)但無顯著性意義，DNMT3A表達顯著下調(diào)(P<0.01)。
　　定量PCR和Western blot實驗分別從mRNA水平和蛋白水平驗證了DNMTs在不同類型滋養(yǎng)細胞(組織)中的表達模式，即與具備一定分化和侵襲潛力的正常胚胎絨毛相比，幾乎失去分化能力的完全型葡萄胎組織中，DNMT1和DNMT3B的表達顯著上調(diào)，DNMT3A表達顯著下調(diào)。上述結(jié)果揭示了不同DNMTs在滋養(yǎng)細胞分化或侵襲中可能發(fā)揮著不

7、同的作用。
　　2.在不同侵襲能力的體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞中，DNMTs表達亦具有差異：與具有較強侵襲能力的HTR-8/SVneo細胞相比，無論在mRNA還是蛋白水平，侵襲能力較低的絨癌來源細胞JEG-3中DNMT1表達均無顯著性差異(P=0.15)；DNMT3A表達下調(diào)(P<0.05)；DNMT3B表達顯著上調(diào)(P<0.01)。
　　綜合分析DNMTs的表達模式顯示：在不同侵襲行為滋養(yǎng)細胞系中，DNMT1的表達并無顯著差異，但

8、在絨毛和完全型葡萄胎中的表達有顯著差異；DNMT3A在侵襲能力較強的HTR-8/SVneo細胞和分化潛力強的胚胎絨毛中高表達；DNMT3B在侵襲能力較低的JEG-3和分化潛力較弱的完全型葡萄胎中高表達，說明DNMTs可能是影響滋養(yǎng)細胞分化和侵襲能力的重要因子，但在功能上有所差異。
　　3.濃度分別為5μm/L和50μm/L的DNMTs抑制劑5-AZA-CdR誘導細胞，western blot檢測該藥物對DNMTs的表達抑制，結(jié)果顯

9、示DNMT1無顯著性表達抑制；DNMT3A的表達抑制有顯著性(P<0.01)，抑制倍數(shù)分別為0.28和0.26；對DNMT3B表達抑制亦較為顯著(P<0.05)，抑制倍數(shù)分別為0.62和0.55。相同條件下，5-AZA-CdR對DNMT3A和DNMT3B表達的抑制能力有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。5-AZA-CdR誘導下，HTR-8/SVneo細胞侵襲能力降低：藥物處理組穿透細胞數(shù)量(7.3±1.3個/視野)與對照組穿透細胞數(shù)量(3

10、6.7±2.9個/視野)相比，有顯著差異(P<0.01)。在調(diào)控滋養(yǎng)細胞侵襲能力方面，DNMT3A顯示出比DNMT1和DNMT3B更為重要的作用。
　　4.5-AZA-CdR誘導下，不同滋養(yǎng)細胞系在形態(tài)學改變、凋亡誘導等方面亦有所差異：HTR-8/SVneo細胞對藥物誘導顯示出一定的抵抗能力，JEG-3細胞則更為敏感。相同濃度和處理時間下，JEG-3細胞較HTR-8/SVneo細胞皺縮、變圓、及死亡脫落更為明顯。JEG-3細胞凋亡

11、數(shù)量(24.57±1.4％)高于HTR-8/SVneo細胞凋亡數(shù)量(10.23±1.04％)，藥物誘導的凋亡細胞數(shù)量在兩種細胞間具有顯著差異(p<0.05)。說明DNMTs在不同滋養(yǎng)細胞中的表達可影響細胞對DNMTs抑制劑的敏感性。
　　5.MeDIP-chip實驗共發(fā)現(xiàn)8146個甲基化位點，其中正常胚胎絨毛，完全型葡萄胎，HTR-8/SVneo和JEG-3細胞系的啟動子甲基化位點分別為4264個，4356個，6712和6395個

12、(PeakScore≥2.0)，在22條常染色體和X染色體上均有分布。異常侵襲行為滋養(yǎng)細胞(完全型葡萄胎和絨癌)中甲基化，而同時在正常滋養(yǎng)細胞(正常胚胎絨毛和HTR-8)中非甲基化的位點涉及基因118個。正常滋養(yǎng)細胞(正常胚胎絨毛和HTR-8/SVneo)中甲基化、異常侵襲行為滋養(yǎng)細胞(完全型葡萄胎和絨癌)中同時為非甲基化的基因位點涉及基因88個。DAVID軟件功能分類結(jié)果顯示，存在差異甲基化位點的基因主要與細胞信號轉(zhuǎn)導，磷脂的轉(zhuǎn)運，細

13、胞骨架組成，細胞周期，生殖過程等相關(guān)。
　　6.MeDIP-chip實驗所發(fā)現(xiàn)的差異甲基化基因，腫瘤蛋白D52(TPD52)、鈣粘附蛋白(CDH1)、層粘連蛋白(LAMA4)等在不同滋養(yǎng)細胞系的差異甲基化模式被甲基化特異性PCR(MSP)證實；TPD52和CDH1的差異甲基化模式進一步被甲基化測序(BSP)實驗所證實。RT-PCR顯示，與JEG-3和JAR細胞相比，TPD52和CDH1基因的表達在HTR-8/SVneo細胞中受到了