大豆花葉病毒膠體金免疫層析試紙條的制備及RT-LAMP檢測(cè).pdf

1、大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是一種在世界上很多國家廣泛分布并極具破壞性的植物病毒，會(huì)導(dǎo)致大豆嚴(yán)重減產(chǎn)和種質(zhì)衰退，每年都給很多國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失，因此，建立一種快速檢測(cè)SMV的方法對(duì)于檢測(cè)和防控大豆花葉病毒的發(fā)生與流行是十分必要的。
　　本研究建立了兩種方法:一種為大豆花葉病毒一步免疫層析檢測(cè)法，該方法利用膠體金標(biāo)記單克隆抗體（mAb）檢測(cè)植物樣品中SMV。一種為逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reve

2、rse-transcription loop-mediated isothermal amplification)檢測(cè)大豆葉片和種子中的SMV的方法，兩種方法都實(shí)現(xiàn)了對(duì)SMV快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
　　SMV的免疫層析試紙條檢測(cè):本研究利用原核表達(dá)方法體外表達(dá)大豆花葉病毒的外殼蛋白，采用腹腔免疫方式免疫小鼠，通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞株，成功制備4株SMV單克隆抗體。并采用雙抗體夾心模式，使用兩株不同特異性的單克隆抗體，制備免疫層

3、析試紙條。一株抗SMV單抗(mAb3E12C6)被固定到在硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)域，而另一株抗SMV單抗（mAb4B8D9）偶聯(lián)到作為顯色劑的膠體金粒子上。然后將植物樣品溶液通過毛細(xì)管作用，與抗SMV IgG抗體在檢測(cè)區(qū)發(fā)生反應(yīng)，使SMV滯留在檢測(cè)區(qū)域，從而出現(xiàn)紅色陽性結(jié)果，檢測(cè)方法快速方便，可在5分鐘內(nèi)出結(jié)果。制備的試紙條可以敏感且特異的檢測(cè)到大豆葉子和種子中攜帶的SMV。
　　SMV的RT-LAMP檢測(cè):本研究根據(jù)GenBank數(shù)

4、據(jù)庫中大豆花葉病毒的外殼蛋白基因序列，設(shè)計(jì)并篩選到了SMV RT-LAMP特異性引物組，應(yīng)用該引物組優(yōu)化了RT-LAMP反應(yīng)參數(shù)，靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RT-LAMP檢測(cè)SMV比普通RT-PCR靈敏度高出10～100倍。結(jié)合RNA粗提法，建立了一步法RT-LAMP快速、靈敏地檢測(cè)到植物葉片中的SMV。加入熒光染料SYBR GreenI則可在反應(yīng)管中直接觀察檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的可視化。該RT-LAMP技術(shù)還可靈敏地檢測(cè)到大豆種子中攜帶的S