臍帶間充質干細胞誘導分化成肝樣細胞的研究.pdf

1、目的:通過分離人臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)，采用系列細胞因子聯(lián)合誘導，探索高效可靠的體外誘導分化為肝樣細胞的技術方法。
　　 方法:采用健康產(chǎn)婦臍帶，用酶消化法分離、培養(yǎng)臍帶間充質干細胞(UCMSC);流式細胞儀檢測細胞抗原CD13、CD44、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表達情況，鑒定分離的細胞是否為UCMSCs;用肝細胞生長因子(

2、hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細胞生長因子-4(Fibroblast growth factor-4FGF-4)及白細胞介素6（Interleukin-6 IL-6）進行組合分組:A組:僅基礎培養(yǎng)基，即為陰性對照組;B組:基礎培養(yǎng)基+HGF+FGF-4;C組:基礎培養(yǎng)基+HGF+IL-6;D組:基礎培養(yǎng)基+HGF+FGF-4+IL-6誘導培養(yǎng)第3代(P3)的臍帶MSCs，用免疫細胞化學法檢測細胞標志物

3、AFP、ALB的表達情況，比較各個誘導組誘導成肝樣細胞的細胞比例。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件包進行分析，用單因素方差分析對資料進行統(tǒng)計分析。
　　 結果:
　　 1.UCMSC的細胞形態(tài)接種的UCMSC多于48小時后貼壁，5天后有短梭形細胞長出，后漸由短梭形變?yōu)榧氶L扁平的長梭形，15天后出現(xiàn)梭形細胞集落，呈漩渦狀或長條形生長，1月后細胞相互接觸，并鋪滿整個培養(yǎng)皿底部。
　

4、　 2.UCMSC鑒定取培養(yǎng)至第三代(P3)的臍帶間充質干細胞行流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達，反映間充質干細胞的表面抗原CD13、CD44、CD105表達陽性，表達率分別為99.0％、98.4％、98.4％，而造血干細胞標志物CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，表達率分別為4.6％、9.48％、5.04％。
　　 3.UCMSC的誘導分化
　　 3.1誘導成肝樣細胞的細胞形態(tài)取培養(yǎng)至第三代的UCMSCs加入各細

5、胞因子組合向肝樣細胞誘導，經(jīng)3～4周呈放射狀的細胞排列結構逐步消失，長梭形細胞變類圓形或多角形，存在離散現(xiàn)象，胞漿出現(xiàn)顆粒，部分出現(xiàn)雙核。
　　 3.2肝樣細胞標志物表達對誘導出的肝樣細胞行其標志物甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)檢測顯示:A組始終沒有見到肝樣細胞的標志物白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)的表達。而B、C、D組可以檢測到肝細胞的標志物AFP、ALB的表達，AFP在誘導7天時，不同誘導組(B、C、D)比較，D

6、組表達率最高;至15天時各組表達均減少，但D組仍最高;至誘導20天時各組表達均消失。而ALB在誘導7天、15天、20天都有強表達。在誘導第7天，B組表達率最高;誘導15天、20天，B、D組表達率高于C組。
　　 結論:
　　 1.使用酶消化法可以從人臍帶中成功分離、培養(yǎng)出UCMSC。
　　 2.應用肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細胞生長因子-4(Fibrobla