豬鏈球菌2型1358hk組氨酸激酶抑制劑篩選.pdf

1、細(xì)菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)(Two-component regulatory system,TCS)是細(xì)菌感應(yīng)外界復(fù)雜環(huán)境,維持自身存活和生長(zhǎng)繁衍的重要感應(yīng)和調(diào)控系統(tǒng)。1358hk/rr雙組份調(diào)控系統(tǒng)是豬鏈球菌2型(S.suis2,SS2)15對(duì)TCS其中一對(duì),在其它細(xì)菌中也普遍存在。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),豬鏈球菌2型1358hk/rr與肺炎鏈球VicK/R同源性較高,氨基酸序列一致性81％。目前研究發(fā)現(xiàn),在肺炎鏈球菌中將VicK組氨酸激酶基因缺失

2、后,發(fā)現(xiàn)它的生長(zhǎng)、生物膜的形成、細(xì)菌鏈的增長(zhǎng)減慢及毒力降低,因此,認(rèn)為其對(duì)肺炎鏈球的生長(zhǎng)是必需的。我們通過大量的工作篩選1358hk/rr’rcs的基因缺失突變株,但一直沒有獲得突變株,推測(cè)1358hk/rr也可能影響豬鏈球2型的生長(zhǎng)或存活。
　　 目前,已有針對(duì)肺炎鏈球菌及表皮葡萄球菌的組氨酸激酶YycG進(jìn)行同源模建,然后在化合物庫中篩選有效的抑制劑的文章,而國(guó)內(nèi)外還沒對(duì)豬鏈球菌2型的研究報(bào)道。因此,我們想通過對(duì)豬鏈球菌2型的

3、組氨酸激酶1358(1358hk)進(jìn)行同源模建后,虛擬篩選出針對(duì)該靶點(diǎn)的能抑制豬鏈球菌2型生長(zhǎng)的先導(dǎo)抑制劑。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.豬鏈球菌2型組氨酸激酶(1358hk)的同源模建和分析
　　 在運(yùn)用同源模建的的方法構(gòu)建1358蛋白的三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,用Procheck軟件對(duì)此結(jié)構(gòu)模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示豬鏈球菌2型組氨酸激酶1358與PDB編號(hào)為3DGE的Thermotoga maritimaⅩ晶體衍射結(jié)構(gòu)

4、(分辨率2.8(A))具有31％的一致性；模建后的1358結(jié)構(gòu)能與模板很好的疊合；結(jié)果顯示:模建的豬鏈球菌2型組氨酸激酶1358達(dá)到了要求,該模型可以用于分子對(duì)接,進(jìn)而進(jìn)行抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選。
　　 2.豬鏈球菌2型組氨酸激酶(1358hK)先導(dǎo)抑制劑的虛擬篩選
　　 我們通過采用FlexX對(duì)SPECS小分子數(shù)據(jù)庫初步的篩選,評(píng)分較高的化合物得到選擇；再采用Xscore程序進(jìn)行打分,獲得一定數(shù)量的化合物；接下來得到1

5、08個(gè)化合物是通過類藥性分析篩選；最后采用FlexX及經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行人工挑選。通過在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行四次不同的篩選,我們最終從SPECS數(shù)據(jù)庫中得到了40個(gè)小分子化合物,并通過購(gòu)買進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 3.豬鏈球菌2型組氨酸激酶(1358hk)功能域片段(1358')的克隆、表達(dá)、純化及活性鑒定
　　 豬鏈球菌2型組氨酸激酶1358是一個(gè)跨膜蛋白,因此我們通過截短其胞內(nèi)的HATPase_c激酶功能域片段(1358')進(jìn)行表達(dá)。通

6、過PCR擴(kuò)增豬鏈球菌2型1358跟ATP結(jié)合的那一部分DNA序列,本實(shí)驗(yàn)的重組質(zhì)粒是通過pET28a載體構(gòu)建。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21后,通過加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h,破碎并用SDS-PAGE鑒定表達(dá)的目的蛋白,純化的1358'蛋白采用熒光激酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的酶活性。最后我們得到1358'大約為35kDa的目的蛋白,純化的目的蛋白能與ATP反應(yīng)。
　　 4.先導(dǎo)化合物的抑酶試驗(yàn)
　　 通過建立酶動(dòng)力學(xué)分析,初步對(duì)在S

7、PECS小分子化合物庫中對(duì)接虛擬篩選并購(gòu)買獲得的40個(gè)化合物,利用激酶試劑盒進(jìn)行初步篩選,得到每個(gè)化合物抑制激酶蛋白分解ATP的抑制率；結(jié)果顯示化合物1在化合物濃度在500μM/L,的抑制率達(dá)到66％,化合物濃度降到100μM/L的抑制率為50％,但沒有抑制豬鏈球菌2型生長(zhǎng)的效果。其它的化合物抑制率相對(duì)化合物1較低,有些化合物在降低濃度后抑制率反而上升,說明這幾種化合物在DMSO中的溶解度不是很好。從而得出我們篩選的化合物在較低濃度條件