PRRSV感染抑制Ⅰ型和Ⅲ型干擾素及激活NF-κB的分子機制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的新發(fā)病毒性傳染病。自1987年首次在美國報道以來,PRRS已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū),并成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一,給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。
　　 PRRSV感染后,僅能誘導低水平、遲緩的中和抗體,而且病毒在機體內持續(xù)感染導致病毒血癥的長期存在。人們推測微弱的天然免疫反應

2、是導致這些現(xiàn)象的根本原因,但其具體分子機制不清楚。為了揭示PRRSV逃避天然免疫的機制,本文對PRRSV感染細胞后的天然免疫反應信號通路進行了研究。具體內容如下:
　　 1.PRRSV感染抑制IFN-β產生分子機制的研究
　　 采用IFN-β熒光素酶報道系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染MARC-145細胞后不能誘導IFN-β的產生,半定量RT-PCR檢測也獲得了相似的結果,而且PRRSV感染能顯著抑制轉染雙鏈RNA(poly(

3、IC))誘導激活的IFN-β產生,提示PRRSV可能通過干擾IFN-β產生的策略進行免疫逃避。進一步檢測了PRRSV感染后NF-kB、AP-1和IRF3的激活情況以及IRF3轉定位,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細胞后能激活NF-kB和AP-1,但抑制IRF3的核轉位和激活。隨后,針對干擾素信號途徑TLR和RIG-Ⅰ進行了深入分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細胞后能降低TLR3接頭蛋白TRIF超表達誘導的IFN-β產生,表明PRRSV可通過干擾TLR3途徑

4、抑制干擾素的產生。另外,在對RIG-Ⅰ信號途徑的分析中,通過IRF3、TBK1、IKKε、IPS-1、RIG-Ⅰ的超表達分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不干擾TBK1和IKKε下游通路的完整性,但損害IPS-1和RIG-Ⅰ的功能,而且此途徑對IFN-β產生的抑制作用明顯強于TLR3途徑,表明PRRSV可通過干擾TLR3和RIG-Ⅰ兩種信號通路抑制IFN-β的產生,但主要依賴于干擾RIG—Ⅰ途徑。
　　 2.PRRSV感染激活NT-κB的

5、分子機制的研究
　　 PRRSV感染后抑制IFN-β的產生,但能顯著激活NF-κB。NF-κB是一類具有多重轉錄調節(jié)作用的核蛋白因子,不僅在天然免疫反應、獲得性免疫反應和細胞的增殖中都有著重要的作用,而且與病毒感染后的炎癥反應密切相關。為了闡明PRRSV感染激活NF-κB的信號通路,分別研究了RIG-Ⅰ和TLR信號通路在PRRSV激活NF-kB的作用。結果顯示PRRSV可通過TLR信號通路中的接頭分子TRIF、MyD88和TRA

6、F6激活NF-κB,而與RIG-Ⅰ信號通路及TRAF2無關。為了進一步挖掘參與NF-κB激活的PRRSV自身編碼蛋白,通過NF-κB DNA結合試驗和NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)對PRRSV編碼的所有結構蛋白和非結構蛋白進行篩選,發(fā)現(xiàn)結構蛋白N蛋白和非結構蛋白Nsp2能夠顯著誘導NF-κB的激活?？紤]到N蛋白在PRRSV中的高度保守性,進一步構建了N蛋白不同區(qū)域缺失的11種突變體,通過NF-κB熒光素酶報道系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)N蛋白的30-73

7、位氨基酸是激活NF-κB必需的,而該區(qū)域正好位于N蛋白的RNA結合域和核定位區(qū)域,提示N蛋白的RNA結合域和核定位區(qū)域可能在激活NF-κB以及隨后的親炎癥因子的產生中具有重要作用。
　　 3.PRRSV感染抑制IFN-λ1產生分子機制的研究
　　 IFN-λ是最近才發(fā)現(xiàn)的一類新的Ⅲ型干擾素。為了探討PRRSV感染后IFN-λ的表達及其可能的作用機制,通過熒光定量RT-PCR分析了PRRSV感染細胞后不同時間IFN-λ1

8、mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不能誘導IFN-λ1的產生,提示抑制IFN-λ的產生是PRRSV的另一種有效的免疫逃避策略。通過IFN-λ1啟動子順式作用元件的分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染抑制dsRNA誘導的IFN-λ1的產生主要通過抑制轉錄因子IRF的活性。進一步通過IFN-λ1啟動子熒光素酶報道系統(tǒng)并結合參與干擾素誘導的各種信號分子,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不干擾IRF3、TBK1和IKKε下游通路的完整性,但干擾RIG-Ⅰ的接頭分子IPS

9、-1的活性,從而抑制RIG-Ⅰ誘導的IFN-λ1的產生。與PRRSV感染抑制IFN-β產生的信號通路不同的是,PRRSV感染對TLR3的接頭分子TRIF誘導的IFN-λ1的產生卻沒有明顯的影響,提示PRRSV感染主要通過干擾RIG-Ⅰ信號通路抑制IFN-λ1的產生。
　　 4.不同類型干擾素抑制PRRSV增殖的比較研究
　　 PRRSV對干擾素的高度敏感性提示干擾素可以作為抗PRRSV感染的一種潛在的治療性制劑。迄今為止

10、,已有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素被發(fā)現(xiàn)。為了比較不同類型干擾素抗PRRSV的效果和可能的作用機制,分別測定了IFN-α2、IFN—β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)和IFN-λ2(IL-28a)對PRRSV增殖的影響。結果表明,所有的干擾素對PRRSV的增殖都有抑制效果且呈劑量依賴性,但是Ⅰ型和Ⅲ型干擾素抑制PRRSV的增殖的效果明顯強于Ⅱ型干擾素。任何兩種干擾素的聯(lián)合作用都沒有顯著地提高它們的抗PRRSV效果。此外,IFN-α2、