幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨再生修復相關(guān)因子的基因克隆與功能研究.pdf

1、研究背景：關(guān)節(jié)損傷后的治療非常困難，是骨科臨床面臨的難題，關(guān)節(jié)損傷后難以修復及功能恢復的關(guān)鍵原因是：關(guān)節(jié)軟骨不能很好的修復，在損傷關(guān)節(jié)軟骨表面尚無有效方法再生透明軟骨層。文獻報道，幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷后能夠接近完全再生，修復組織中透明軟骨超過80％，修復組織的機械性能和耐久度接近正常的關(guān)節(jié)軟骨，而成年新西蘭白兔在關(guān)節(jié)軟骨損傷部位只能形成纖維瘢痕修復，修復組織透明軟骨含量低。這種修復的差異，推測是因為在損傷部位存在著與修復相關(guān)的基因

2、表達差異。以具有軟骨再生能力的動物為模型，尋找并研究損傷部位局部早期的基因表達，有可能發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷后再生修復的重要基因，進一步研究目標基因的功能，具有重要意義和價值。
　　 目的：利用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建幼年新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)損傷后修復組織差異表達基因文庫，并通過測序、生物信息學檢索篩選膝關(guān)節(jié)損傷后修復相關(guān)基因，并進一步通過RACE 技術(shù)克隆未報到基因全長基因序列，進行蛋白表達、純化并初步研究其對間充質(zhì)干細胞增值及形態(tài)學的影響。

3、
　　 方法：采用一步法和植物RNA 提取方法相結(jié)合，提取關(guān)節(jié)損傷修復組織總RNA，應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，篩選幼年新西蘭白兔損傷膝關(guān)節(jié)修復組織差異表達基因。選擇具有親子關(guān)系的50周齡成年新西蘭雌性白兔及其子代８周齡幼年新西蘭白兔(雌雄不限)共３對。在膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面背側(cè)用鉆頭制造直徑3mm 深3mm的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織的缺損，取傷后4周損傷部位修復組織作為實驗標本。幼年新西蘭白兔的修復組織為檢測組(Tester)

4、；成年親代雌性新西蘭白兔的修復組織為驅(qū)動組(Driver)。酶切雙鏈cDNA 成具有平頭末端的小片段，將Tester組平頭末端連接接頭Adaptor1或Adaptor 2R，與酶切后的Driver組進行兩次消減雜交和兩輪抑制性擴增，產(chǎn)物連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，藍白斑篩選陽性克隆，建立消減cDNA文庫。PCR 檢驗陽性插入片斷，每個陽性克隆搖菌擴增后送上海生物工程公司測序。應(yīng)用Chromas 軟件去除測序結(jié)果

5、中載體序列及插入片斷兩端的接頭序列得到抑制性消減EST 片斷，應(yīng)用DNAStar 5.01對片斷進行重疊群合并及電子拼接，得到差顯基因片斷的序列信息，在GeneBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，反向Northern 斑點雜交驗證差顯基因片段，選擇有意義的已知基因及未報到基因片段進行后續(xù)功能研究。應(yīng)用RACE 技術(shù)克隆未報到的10號和12 號差異表達基因片段的全長基因序列，通過電子拼接獲得電子全長，并通過高保真酶擴增出物理全長，以pQE3

6、0為載體，構(gòu)建原核表達載體，進行蛋白表達、純化，獲得目標基因的蛋白表達產(chǎn)物。抽取成年新西蘭白兔骨髓組織，通過全骨髓培養(yǎng)法進行骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和純化，應(yīng)用MTt技術(shù)檢測不同濃度梯度的目標蛋白對間充質(zhì)干細胞增值的影響，選擇促進增值作用最強的蛋白濃度進行間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，通過免疫熒光技術(shù)，對間充質(zhì)干細胞的細胞骨架進行染色，觀察目標蛋白對間充質(zhì)干細胞形態(tài)學的影響。研究已知基因VEGF在關(guān)節(jié)損傷修復過程中的作用。成年新西蘭白兔60只，隨機

7、分成基因轉(zhuǎn)染組、空白對照組和空載體對照組。構(gòu)建AdhVEGF121腺病毒表達載體，通過無水酒精注射造成股骨頭壞死模型，進行目的基因轉(zhuǎn)導，于損傷后不同時相點處死動物，取壞死區(qū)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織，通過RT-PCR 檢測VEGF在修復組織中的表達，通過HE 染色進行病理學觀察，并對修復組織的軟骨下骨進行骨密度測量及骨小梁形態(tài)學測量，利用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，比較各組的修復差異。
　　 結(jié)果：一步法結(jié)合植物RNA 提取法

8、提取的總RNA 簡單快速、純度高、完整性和穩(wěn)定性好，成功逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。應(yīng)用SMART與SSH 相結(jié)合的技術(shù)構(gòu)建了幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)損傷修復組織差異表達cDNA文庫。藍白斑篩選獲得223個陽性菌落，隨機選擇64個陽性克隆進行PCR 驗證，真陽性率超過90％。送217個測序，成功測序199個。通過軟件拼接得到13個差異表達基因序列信息，反向Northern 雜交證實13個差顯基因有12個均在幼年新西蘭白兔修復組織中高表達，包括6

9、條線粒體基因、核糖體基因和管家基因。有一條基因表達無明顯差異。其余6個基因片斷，有4 條是已知基因片段，分別是A6：XI 型膠原α1鏈，A37：兔皮質(zhì)穩(wěn)定素4，A45：人類PRO1073，A79：血管內(nèi)皮細胞生長因子。另外2 條基因，克隆編號：A78、A80，經(jīng)過檢索未見全長基因報到，只有部分序列(CDS)報道，且在幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)修復組織中高表達。差顯基因片斷均在GeneBank 登錄并獲得注冊。應(yīng)用RACE 技術(shù)成功克隆了未報

10、到的10號和12 號差異表達基因片段的全長基因序列，通過電子拼接獲得樂全長序列信息，在GenBank中獲得注冊，注冊號為FJ571518何FJ571519。.根據(jù)電子全長設(shè)計基因特異性引物，通過高保真酶擴增出物理全長，經(jīng)過對全長基因序列的同源性檢索，10號序列與Ⅰ型膠原前α2 鏈有較高的相似性，相似度為99％，Ⅰ型膠原被稱為骨膠原，國內(nèi)外有大量研究報道。因此放棄對其進行后續(xù)研究。12 號基因與人S100A9 有較高相似度，相似率為90％

11、。查閱文獻未見S100A9在關(guān)節(jié)損傷中的報道。因此對此基因繼續(xù)后續(xù)研究。利用pQE30載體成功構(gòu)建目的基因原核表達載體pQE30-12-IGI，通過蛋白表達、純化，獲得了目標基因的蛋白表達產(chǎn)物100微克左右，蛋白為可溶性蛋白。通過全骨髓培養(yǎng)法成功分離純化出骨髓間充質(zhì)干細胞進行了傳代培養(yǎng)，對傳代細胞， MTT 檢測發(fā)現(xiàn)12 號蛋白能夠明顯促進充質(zhì)干細胞增值，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)12 號蛋白引起間充質(zhì)干細胞細胞骨架增生，細胞發(fā)生肥大性反應(yīng)。通過

12、RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在目的基因轉(zhuǎn)染組壞死股骨頭關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的修復組織中VEGF表達明顯高于對照組，轉(zhuǎn)染VEGF后，HE 染色提示軟骨下壞死區(qū)新生的骨小梁明顯優(yōu)于對照組，而在兩個對照組，均有不同程度的骨吸收及空隙形成。目的基因轉(zhuǎn)染組的骨密度明顯高于2個對照組，骨小梁平均寬度大于對照組，骨小梁平均間隙小于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、植物總RNA 提取方法與一步法結(jié)合，簡便、快速、經(jīng)濟，適合提

13、取關(guān)節(jié)軟骨組織小量總RNA。
　　 2、幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)損傷4周后，基因表達明顯活躍，反向Northen 斑點雜交提示有12個基因表達明顯上調(diào)，其中包括與軟骨細胞及骨細胞的細胞外基質(zhì)的合成及新陳代謝密切相關(guān)的已知差異表達基因：血管內(nèi)皮細胞生長因子、皮質(zhì)穩(wěn)定素4、XI型膠原α1鏈，以及2個未見全長基因報道的基因片斷。進一步研究這些差異表達基因具有重要意義。
　　 3、應(yīng)用RACE 技術(shù)成功克隆出A78 號、A80號基因的

14、全長序列信息，同源性檢索鑒定10號基因與人類Ⅰ型膠原前α2 鏈有高度的同源性，12 號基因與人類S100A9基因具有較高同源性，在GenBank中均獲得注冊。通過對目標基因12 號基因的蛋白表達和純化，獲得了有活性的蛋白表達產(chǎn)物。12 號蛋白能夠明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞增值，并能夠引起骨髓間充質(zhì)干細胞細胞骨架增生，細胞發(fā)生肥大性反應(yīng)。
　　 4、差異表達基因VEGF 可能通過促進股骨頭壞死區(qū)血運重建及骨的形成，間接保護壞死區(qū)骨小