豬巨噬細(xì)胞感染不同基因型弓形蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)是人獸共患寄生蟲(chóng)病，可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?，通過(guò)其分泌蛋白改變宿主細(xì)胞的信號(hào)通路狀態(tài)、調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響宿主的生命活動(dòng)進(jìn)程。根據(jù)弓形蟲(chóng)感染小鼠的毒力可以分為:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，人們生活水平的不斷提高，對(duì)豬肉的需求大幅上漲，然而豬弓形蟲(chóng)病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也造成了我國(guó)居民弓形蟲(chóng)感染率的上升。由于目前對(duì)弓形蟲(chóng)病防控的基礎(chǔ)研究不足，尤其是對(duì)弓形蟲(chóng)與宿主之間相互作用的分子機(jī)

2、制尚不清楚。因此，國(guó)內(nèi)外許多科研工作者建立動(dòng)物模型，用于研究對(duì)弓形蟲(chóng)與宿主之間相互作用的分子機(jī)制。
　　本研究利用RNA-Seq高通量測(cè)序研究不同基因型弓形蟲(chóng)對(duì)豬巨噬細(xì)胞感染后的轉(zhuǎn)錄組變化，鑒定出弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞后的差異表達(dá)的基因及免疫途徑，發(fā)現(xiàn)不同基因型弓形蟲(chóng)在調(diào)控型Ⅰ干擾素和NF-κB信號(hào)通路的差異，通過(guò)弓形蟲(chóng)感染BALB/c小鼠，利用Real-time PCR檢測(cè)小鼠脾臟中細(xì)胞因子的變化，同時(shí)利用Western Blot研究G

3、RA15調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制，將質(zhì)粒GRA15電轉(zhuǎn)到RAW264.7細(xì)胞，研究其對(duì)免疫因子的影響。
　　(1)不同基因型弓形蟲(chóng)的速殖子感染3D4/21細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析
　　將RH、HB1和ME49弓形蟲(chóng)速殖子感染3D4/21細(xì)胞，利用RNA-Seq高通量測(cè)序檢測(cè)6h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，Ⅱ型蟲(chóng)株誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因明顯高于Ⅰ型蟲(chóng)株，進(jìn)行GO富集和KEGG分析

4、，三種弓形蟲(chóng)速殖子在涉及巨噬細(xì)胞的免疫或疾病相關(guān)途徑存在差異。
　　(2)不同基因型弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠脾臟的免疫因子的影響
　　通過(guò)腹腔接種弓形蟲(chóng)Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠，根據(jù)不同基因型弓形蟲(chóng)的毒力，設(shè)置不同的時(shí)間間隔來(lái)定時(shí)收取脾臟組織。利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠先天性免疫細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在RH、HB1急性感染和Me4

5、9慢性感染中，IFN-γ和IL-10的表達(dá)變化十分明顯，且均在感染后期有著很高的表達(dá)量。而相對(duì)地，PD-1在各基因型弓形蟲(chóng)感染中所誘導(dǎo)的表達(dá)量較低，且隨時(shí)間變化不太明顯。
　　(3)GRA15激活NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制
　　將GRA15質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中IκB和p-IκB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p-IκB的表達(dá)水平顯著增加，當(dāng)使用IκB激酶抑制劑MG-132后p-IκB表達(dá)水平

6、明顯減少。結(jié)果說(shuō)明GRA15有可能是通過(guò)降解IκB蛋白來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路。
　　(4)GRA15對(duì)RAW264.7細(xì)胞因子的影響
　　使用電穿孔法將GRA15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，分別收集12h和24h的細(xì)胞，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GRA15(-4)可以引起細(xì)胞IFN-β表達(dá)量的顯著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)則可以激活并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFN-γ;而G

7、RA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)對(duì)IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均無(wú)明顯影響。
　　本研究首次對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)感染不同基因型弓形蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究和分析，描述了細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)后差異基因的表達(dá)變化。同時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)鑒定的功能性差異表達(dá)基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御機(jī)制，促進(jìn)對(duì)弓形蟲(chóng)感染的預(yù)防和控制，了解這些途徑提供的信息可能對(duì)開(kāi)發(fā)合理設(shè)計(jì)的弓形蟲(chóng)治療劑和疫苗至關(guān)