代謝酶活性檢測熒光探針的設計、合成及應用.pdf

1、代謝酶是機體防御和清除外來物質(zhì)入侵的重要生化屏障，同時在維系機體內(nèi)源性物質(zhì)代謝平衡中也發(fā)揮著至關重要的作用。國內(nèi)外學者一直致力于開發(fā)特異性的代謝酶底物，以實現(xiàn)對生物體系中特定代謝酶的活性定量檢測和功能評估。相較于非熒光底物，熒光底物因其具有檢測靈敏、操作快捷、能夠實現(xiàn)實時檢測和適合高通量篩選等優(yōu)勢而備受關注。但由于機體內(nèi)代謝酶種類繁多，部分代謝酶氨基酸序列相似性高，其底物譜多有重疊，所以目前鮮有特異性代謝酶熒光探針底物相關的報道。本文設

2、計、合成了檢測羧酸酯酶（亞型1和亞型2）、細胞色素P450酶（亞型1A1）和人血清白蛋白活性的具有高選擇性識別能力的熒光探針，為深入探究它們在生物體系的功能以及臨床個性化用藥方面提供了工具。
　　(1)羧酸酯酶1作為人體內(nèi)一種重要的羧酸酯酶亞型，不僅能催化多種內(nèi)源性和外源性酯類分子的水解，并參與機體的多種生理和病理過程。從2-羥基苯并噁唑出發(fā)，設計、合成了一個檢測羧酸酯酶2活性的雙光子熒光探針BABO，該探針最低檢測限為0.04μ

3、g/mL，能夠檢測不同組織微粒體中羧酸酯酶1活性差異，對活細胞和肝組織切片中羧酸酯酶1進行雙光子激發(fā)熒光成像。BABO適用于研究羧酸酯酶1代謝相關的藥物研發(fā)，探究其在生物體系中的分布和功能。
　　(2)羧酸酯酶2是人體內(nèi)另外一種重要的羧酸酯酶亞型，參與多種化療前體藥物的代謝活化?；诜肿觾?nèi)電荷轉移機理，利用2-二氰基亞甲基-3-氰基-4，5，5-三甲基-2，5-二氫呋喃衍生物為熒光團，設計、合成了一個檢測羧酸酯酶2活性的長波長（λ

4、em=612 nm）熒光探針TCFB，單酶篩選以及抑制實驗都表明TCFB具有極高的亞型選擇性，其良好的細胞透膜能力以及較低的細胞毒性和背景熒光使其適用于檢測活細胞中內(nèi)源性羧酸酯酶2。
　　基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉移機理，從3-羥基黃酮熒光團出發(fā)，設計、合成了一個熒光探針3-AF，首次實現(xiàn)了羧酸酯酶2活性的比率型信號檢測，減小系統(tǒng)誤差以及探針濃度分布不均等原因造成的影響。3-AF適用于復雜酶體系中羧酸酯酶2的檢測，為預測其介導的藥物分

5、子代謝消除的快慢，個性化用藥治療提供了依據(jù)。
　　(3)人血清白蛋白具有多種生理功能，其在血清中的含量可以作為許多疾病發(fā)生、發(fā)展的標志物。從DDAO(1，3-二氯-7-羥基-9，9-二甲基-2(9H)-吖啶酮）熒光團出發(fā)，基于分子內(nèi)電荷轉移機理設計、合成了一個檢測白蛋白活性的熒光底物DDAP，該探針基于白蛋白假酯酶活性設計而成，其代謝產(chǎn)物具有近紅外發(fā)射(λem=660 nm)，進一步提高了信噪比，其最低檢測限為5.6 mg/L，D

6、DAP能檢測人血漿中白蛋白含量和人肝癌細胞分泌白蛋白能力。此外，作為反應型探針，DDAP能夠區(qū)分熱致變性的白蛋白，而結合型探針無法區(qū)分，這對于檢測具有生理活性的白蛋白含量具有重要意義。
　　(4)細胞色素P4501A1是CYP1A亞家族的一員，在前致癌物和有毒物質(zhì)的生物轉化方面發(fā)揮重要作用，同時也在一些藥物的代謝清除中扮演著重要角色。從試鹵靈熒光團出發(fā)，基于分子內(nèi)電荷轉移機理開發(fā)了一個檢測CYP1A1活性的熒光底物CHPO，該探針