腸出血性大腸桿菌O157-H7膠體金檢測試紙條的研制及其應(yīng)用.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)是腹瀉性大腸桿菌中重要的一類，屬于人畜共患病原菌。主要引起人的出血性腸炎。其中O157∶H7是它的一個重要的血清型，在全世界眾多散發(fā)或暴發(fā)流行的腹瀉病例中經(jīng)常涉及到。EHEC O157∶H7主要是通過污染食物被人類食用后引發(fā)感染，屬于食源性致病菌。并且少量的活菌就能導(dǎo)致EHECO157∶H7的感染，使得疾病發(fā)生的危險高于其他病原菌。因此，加強(qiáng)EHEC O157∶H7的檢測極為重要。而傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法耗時

2、長，操作繁瑣。其他的一些實(shí)驗(yàn)室檢測方法對儀器設(shè)備及操作人員都有一定的要求，不適用于基層檢測及大批量樣品的篩查。本研究利用兩株特異性的單克隆抗體，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，以建立一種靈敏、特異、快速、簡便的EHEC O157∶H7檢測方法。
　　 1.EHEC O157∶H7單克隆抗體的篩選
　　 利用相加ELISA試驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室制備的8株針對EHEC O157∶H7菌體抗原的單克隆抗體進(jìn)行篩選，挑選出抗原識別表位影響最小的兩

3、株單抗1H3、6F4。其中1H3為IgG，6F4為IgM。對6F4進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記，對1H3和HRP-6F4進(jìn)行競爭ELISA試驗(yàn)，證明兩株單抗之間抗原識別表位基本無影響，而兩株單抗的效價均在1×105以上，可以用于制備雙抗夾心法的膠體金試紙條。
　　 2.1H3、6F4雜交瘤細(xì)胞株的復(fù)蘇及單克隆抗體的生產(chǎn)制備
　　 對兩株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇，注射雜交瘤細(xì)胞于BALB/c小鼠腹腔，進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)。使用辛酸硫

4、酸銨沉淀法對1H3進(jìn)行純化，對6F4進(jìn)行硫酸銨粗提以及Sephadex G-200過柱純化，純化后的SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩株單抗的雜帶很少，純度較高。1H3純化后濃度為2.58mg/mL，6F4為1.00mg/mL。
　　 3.膠體金免疫試紙條的研制
　　 以1H3作為膠體金標(biāo)記抗體，標(biāo)記后噴涂于玻璃纖維膜上，涂布量為20.0μL/mL;以6F4為捕獲抗體包被于硝酸纖維素膜上，作為檢測線，包被量為1.0μL/cm（

5、1.0 mg/mL）;再在硝酸纖維素膜后端包被兔抗鼠IgG，作為質(zhì)控線，包被量為0.5μL/cm（1.0mg/mL）。組裝制備膠體金試紙條。利用該試紙條對EHECO157∶H7、11種非O157∶H7的大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌進(jìn)行檢測，除EHEC O157∶H7在檢測線處顯示出紅色條帶，其他菌株均為陰性，表明該試紙條的特異性良好。對EHEC O157∶H7純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，檢測下限為1×105CFU/mL

6、。對牛奶以及豬肉樣品進(jìn)行人工污染試驗(yàn)，增菌6h后，靈敏度為10CFU/mL-100CFU/mL。
　　 4.膠體金免疫試紙條的初步應(yīng)用
　　 對武漢市鮮肉市場采集的200份豬肉樣品進(jìn)行檢測。使用改良EC肉湯增菌12h，100℃水浴30min處理增菌液，對處理后的增菌液進(jìn)行膠體金試紙條檢測，200份樣品中檢測出1份陽性。同時使用國家標(biāo)準(zhǔn)上規(guī)定的常規(guī)培養(yǎng)法以及實(shí)驗(yàn)室已建立的二重PCR方法進(jìn)行平行檢測，三種方法的符合率為100