熒光假單胞菌分離鑒定、生物膜形成及免疫磁珠檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、嗜冷菌是指在4℃到25℃可以生長(zhǎng)的微生物總稱(chēng)，熒光假單胞菌屬于假單胞菌屬，是嗜冷菌中的優(yōu)勢(shì)菌株。熒光假單胞菌分泌的蛋白酶和酯酶等代謝產(chǎn)物難以用高溫滅活，在冷藏過(guò)程中影響食品的風(fēng)味等物化性質(zhì)，并常在生產(chǎn)設(shè)備表面形成生物膜，對(duì)食品生產(chǎn)可能帶來(lái)持續(xù)污染。本試驗(yàn)從原料乳中分離熒光假單胞菌，進(jìn)行生物膜形成的定性定量觀察以及納米銀的抑制效果評(píng)價(jià)，并開(kāi)發(fā)以免疫磁珠分離為基礎(chǔ)的ELISA檢測(cè)方法，為控制食品生產(chǎn)中的熒光假單胞菌污染提供支持。主要研究結(jié)果

2、如下：
　　1、從原料乳中分離純化得到在紫外線照射下發(fā)熒光的單菌落，經(jīng)生理生化鑒定，得到8株疑似熒光假單胞菌株，經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序確定4株為熒光假單胞菌。以甲醛滅活的熒光假單胞菌為抗原制備疫苗，免疫新西蘭大白兔后得到抗血清，用辛酸-硫酸銨法初步純化后用 ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)。BCA法測(cè)定后得到純化血清中抗體濃度為2.566mg/mL，1、2號(hào)兔子效價(jià)均為12800。
　　2、通過(guò)結(jié)晶紫染色方法對(duì)熒光假單胞菌生物膜的

3、形成進(jìn)行定性觀察表明，該菌在培養(yǎng)12h后開(kāi)始團(tuán)聚硅膠片上形成生物膜，48h形成較為致密的生物膜結(jié)構(gòu)。分別研究NaCl濃度、溫度、pH、初始菌濃度對(duì)熒光假單胞菌生物膜生長(zhǎng)影響，在NaCl濃度0.05mol/L-0.1mol/L，培養(yǎng)溫度25℃，pH為7.5，初始菌濃度8logCFU/mL時(shí)，熒光假單胞菌最易形成生物膜；當(dāng)碳源為葡萄糖和氮源為大豆蛋白時(shí)，熒光假單胞菌最易形成生物膜。
　　3、分別以空白和0.4％納米銀EVA載體培養(yǎng)熒光

4、假單胞菌生物膜，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定生物膜的變化曲線，普通顯微鏡觀察生物膜形成并計(jì)算覆蓋率(BCR)，掃描電鏡觀察生物膜的微觀結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜中細(xì)菌狀態(tài)。結(jié)果表明，空白、納米銀載體上生物膜分別在12h和24h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，納米銀載體上各時(shí)間點(diǎn)的菌數(shù)及 BCR顯著低于空白載體；在10000倍的視野中，空白載體上的熒光假單胞菌通過(guò)胞外基質(zhì)和菌體形成致密生物膜，納米銀載體上多為分散菌體；在24h、48h時(shí)，納米銀載體上的死亡菌體

5、數(shù)量顯著高于空白載體。
　　4、用共沉淀方法制備得平均粒徑為10nm的納米四氧化三鐵磁珠，其磁飽和強(qiáng)度為51.061emu/g，分散性較好，達(dá)到生物應(yīng)用的要求。將抗血清與四氧化三鐵磁珠偶聯(lián)以建立檢測(cè)熒光假單胞菌的免疫磁珠方法，并與其他病原菌進(jìn)行交叉反應(yīng)，驗(yàn)證其檢測(cè)效果。結(jié)果表明，磁珠偶聯(lián)抗體成功，ELISA方法和免疫磁珠法IC50分別為106.6CFU/mL和104.2CFU/mL。免疫磁珠法靈敏度高，與其他致病菌交叉反應(yīng)性較低，