魚(yú)類(lèi)膠原蛋白的分離純化及其過(guò)敏原性研究.pdf

1、食物過(guò)敏是人類(lèi)常見(jiàn)的一種過(guò)敏性疾病，主要由食物中的蛋白質(zhì)引起，表現(xiàn)為哮喘、蕁麻疹、皮膚瘙癢等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起過(guò)敏性休克甚至危及生命。在引發(fā)過(guò)敏的食物中，水產(chǎn)品是非常重要的一類(lèi)。已有的研究表明，原肌球蛋白和精氨酸激酶為甲殼類(lèi)過(guò)敏原，小清蛋白為魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原。近年來(lái)有報(bào)道稱(chēng)膠原蛋白可能為魚(yú)類(lèi)的新型過(guò)敏原。羅非魚(yú)（Tilapia zillii）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio carpio）為國(guó)內(nèi)最常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣

2、大消費(fèi)者的喜愛(ài)。本文以這兩種魚(yú)類(lèi)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，主要進(jìn)行了膠原蛋白的分離純化、抗體制備、穩(wěn)定性和IgE 結(jié)合活性比較、過(guò)敏性分析等研究。
　　 首先采用堿溶、酸溶、NaCl 鹽析等方法，從羅非魚(yú)和鯉魚(yú)的魚(yú)皮中分離純化得到了膠原蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示，兩種膠原蛋白均由α1（120 kDa）、α2（115 kDa）、β（250 kDa）、γ亞基等組成。雙向電泳結(jié)果顯示，羅非魚(yú)膠原蛋白的pI約為9.0，并

3、確認(rèn)了其α1、α2、β亞基的分子量及純度。以純化的羅非魚(yú)膠原蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗羅非魚(yú)膠原蛋白的多克隆抗體。
　　 通過(guò)不同溫度加熱、不同pH 緩沖液、模擬胃液消化等方法處理，進(jìn)行了純化膠原蛋白與鰱魚(yú)小清蛋白的穩(wěn)定性比較。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性不如小清蛋白，pH 穩(wěn)定性?xún)烧呦嗨疲z原蛋白比小清蛋白更耐胃蛋白酶消化。通過(guò)羅非魚(yú)膠原蛋白加熱處理后樣品的模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)，表明0 ℃與50 ℃加熱處理

4、對(duì)于膠原蛋白的胃蛋白酶消化沒(méi)有明顯影響。羅非魚(yú)膠原蛋白的二相消化實(shí)驗(yàn)表明，膠原蛋白模擬胃液消化產(chǎn)物分子量在120 kDa 以下，繼續(xù)進(jìn)行模擬腸液消化后，消化產(chǎn)物分子量下降至80 kDa 以下。
　　 通過(guò)carboxymethyl-cellulose 預(yù)裝柱（5 mL）的離子交換層析實(shí)驗(yàn)，以0-1 mol/L NaCl梯度洗脫方法純化得到了羅非魚(yú)膠原蛋白的α1 亞基，以0.13 mol/L NaCl 與0.17 mol/L Na

5、Cl分步洗脫方法純化得到了α2 亞基。魚(yú)類(lèi)過(guò)敏患者血清的ELISA 結(jié)果顯示，膠原蛋白及其亞基均呈現(xiàn)了IgE 結(jié)合活性，對(duì)于8 份魚(yú)類(lèi)過(guò)敏患者血清，膠原蛋白的特異性IgE 反應(yīng)率為50％、α1 為37.5％，α2 為50％。魚(yú)類(lèi)過(guò)敏患者血清的dot-blotting 結(jié)果顯示，羅非魚(yú)和鯉魚(yú)膠原蛋白均出現(xiàn)了特異性雜交斑點(diǎn)；western-blotting 結(jié)果顯示，羅非魚(yú)膠原蛋白的α1、α2 以及β亞基均出現(xiàn)了特異性的雜交條帶，但α1、α

6、2 亞基單獨(dú)與魚(yú)類(lèi)過(guò)敏患者血清未出現(xiàn)特異性的雜交條帶。
　　 采用制備的兔抗羅非魚(yú)膠原蛋白的多克隆抗體，對(duì)兩種魚(yú)肉粗提物的膠原成分進(jìn)行了檢測(cè)。從兩種粗提物中均檢測(cè)到了特異性雜交條帶，分子量大約為100 kDa 與200 kDa。
　　 在羅非魚(yú)粗提物中62 kDa 處額外檢測(cè)到了一條帶，推測(cè)為膠原蛋白的降解產(chǎn)物。對(duì)于鯉魚(yú)粗提物經(jīng)加熱后的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示在47.5-100 kDa 處出現(xiàn)了特異性雜交條帶，推測(cè)為膠原