人參皂苷Rg1拮抗致衰劑致骨髓基質(zhì)細胞衰老作用及機理研究.pdf

1、背景：衰老生物學與延緩衰老是社會科學和自然科學共同關注的重大研究課題。2014年國家統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示，中國總人口為13.6億人,其中年齡超過60歲者達2.02億，占14.9％，到2020年，中國將進入超級老齡化國家。面臨世界和我國人口老化進程加快和人們壽命普遍提高的趨勢，確保老年人享有健康和高質(zhì)量生活已成為社會科學和生命科學共同關注重大問題。因此加快推動衰老生物學與延緩衰老的研究有重要科學意義及社會價值。
　　最新研究表明，機體

2、干細胞衰老是生物個體衰老最直接和根本原因。因此，尋找調(diào)控與延緩干細胞衰老途徑，闡述其現(xiàn)代生物學機理對延緩人體衰老和防治老年性疾病具有重要意義。我們前期工作證明，造血系統(tǒng)功能衰退與造血干細胞（HSCs）衰老密切相關，采用中醫(yī)學“補氣生血”途徑可以延緩HSCs衰老。現(xiàn)代血液學理論認為，血細胞發(fā)生是指HSCs在造血誘導微環(huán)境（HIM）的精密調(diào)控下生成與釋放血細胞的動態(tài)平衡過程。HIM是HSCs賴以生長發(fā)育微環(huán)境，HIM的核心成分是骨髓基質(zhì)細胞

3、（BMSCs），它包括巨噬細胞、成纖維細胞、網(wǎng)狀細胞、間充質(zhì)干細胞和血竇內(nèi)皮細胞等，它們不僅為造血細胞生長發(fā)育提供支架，而且能分泌多種造血生長因子調(diào)控造血細胞增殖與分化。可見，BMSCs的生物學特點直接反映造血微環(huán)境功能狀態(tài)。HSCs衰老與HIM功能狀態(tài)密切相關，闡述HSCs衰老機制和尋找延緩 HSCs途徑必然離不開對BMSCs功能的研究。
　　人參是中醫(yī)臨床“補氣”要藥，人參皂苷是其主要的藥物成分。課題組前期研究表明，人參皂苷

4、Rg1是人參重要的抗衰老成分，它能拮抗致衰劑對HSC的致衰作用，能使細胞體外生存壽命延長，給衰老大鼠注射人參皂苷Rg1可阻止致衰劑對骨髓造血細胞損傷。人參皂苷Rg1能否通過調(diào)控骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細胞的功能，進而延緩HSCs衰老還尚未見相關報道。
　　目的:
　　本研究通過建立D-半乳糖致大鼠衰老模型和BMSCs體外衰老模型，探討人參皂苷Rg1拮抗致衰劑對BMSCs體內(nèi)外衰老作用及其生物學機理，旨在闡釋人參抗衰老成分調(diào)控BM

5、SCs功能與延緩造血細胞衰老的機理，為尋找延緩造血微環(huán)境衰老新途徑提供理論與實驗室依據(jù)。
　　方法:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，觀察細胞形態(tài)，臺盼藍染色檢測細胞活性；密度梯度離心法分離骨髓BMNCs，貼壁培養(yǎng)4h后，收集上層懸浮BMNCs。
　　2.通過衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色，CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測、電鏡觀察亞細胞結構的方法觀察D-gal對BMSCs衰老生物學指標

6、的影響，以建立D-gal體外誘導BMSCs衰老模型。
　　3.將懸浮BMNCs與衰老BMSCs共培養(yǎng)，應用SA-β-Gal染色，CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測，CFU-Mix混合集落形成能力檢測的方法觀察衰老BMSCs對BMNCs衰老生物學指標及造血功能的影響，
　　4.Rg1與D-gal共培養(yǎng)BMSCs，應用SA-β-Gal染色，透射電鏡觀察亞細胞結構，CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測，酶學免疫法培養(yǎng)上清中IL-

7、2、IL-6、TNF-α、GM-CSF、SCF、IL-1β分泌水平，DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度，WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力，TBA法檢測胞內(nèi)MDA含量，Western blot檢測P53、P21、P16、CDK2、CDK4、cyclinD、cyclinE的方法，從BMSCs衰老生物學特點、氧化與抗氧化指標、細胞因子表達水平、衰老相關蛋白表達的角度觀察Rg1拮抗BMSCs衰老機理。

8、　　5.Rg1與D-gal作用BMSCs后與BMNCs共培養(yǎng)，應用SA-β-Gal染色，CFU-Mix混合集落形成能力，CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測，DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度，WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力，TBA法檢測MDA含量，從BMNCs衰老生物學特點、氧化與抗氧化指標、細胞因子分泌水平的改變?nèi)矫嬗^察Rg1拮抗BMSCs后對BMNCs衰老抑制作用及其促進BMNCs增殖分化及

9、造血功能恢復的機理。
　　6.大鼠皮下注射D-gal建立衰老大鼠衰老體內(nèi)模型，分離純化BMSCs及BMNCs后，應用SA-β-Gal染色、CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老生物學指標。
　　7.應用SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細胞周期檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMNCs衰老生物學指標。
　　8.人參皂苷Rg1注射衰老大鼠，分離純化BMSCs及BMNCs后，應用

10、SA-β-Gal染色、CCK8比色法、細胞周期及凋亡率檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS含量，酶免疫法檢測培養(yǎng)上清液中水平氧化損傷指標 MDA、SOD、GSH-Px及細胞因子 IL-2、IL-6、TNF-α、SCF、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16、CDK2及cyclinD表達水平的方法從衰老生物學指標、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達的方面觀察Rg1拮抗衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老的機理。
　　9.應用

11、SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細胞周期檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi) ROS水平、WST-8檢測胞內(nèi)SOD活力、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達水平的方法，并結合之前的實驗結果，從衰老生物學指標、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達的角方面觀察Rg1處理衰老大鼠后，體內(nèi)BMNCs衰老延緩及其造血功能恢復的可能機理及其與BMSCs的關系。
　　結果:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)純化后的BMSC

12、s，臺盼藍染色活細胞率為：（96±0.68）%，表明貼壁培養(yǎng)純化后的BMSCs具有良好的生物學特點。
　　2.D-gal作為致衰劑在體外能誘導BMSCs呈現(xiàn)典型的衰老生物學表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細胞率升高，透射電鏡觀察亞細胞結構表現(xiàn)典型衰老形態(tài)學特點：細胞質(zhì)深染、線粒體空泡變性、細胞膜形態(tài)改變，CCK8檢測細胞增殖能力減弱，細胞周期G1期增加、S期減少，細胞凋亡率增加，胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加，激光共聚焦

13、觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯增強，細胞上清液中IL-2、TNF-α升高，IL-6、SCF、GM-CSF、IL-1β降低，胞內(nèi)P53、P21、P16表達水平升高，CDK2、CDK4及cyclinD表達減少，而cyclinE表達水平無明顯改變。
　　3.衰老BMSCs與BMNCs體外共培養(yǎng)，BMNCs呈現(xiàn)衰老的生物學表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細胞率升高，CFU-Mix形成能力減弱，CCK8檢測細胞增殖能力減弱，細胞周期G1期增加、S

14、期減少，細胞凋亡率增加，胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯增強。
　　4.Rg1體外作用衰老BMSCs可降低其SA-β-Gal染色陽性細胞率，增加CCK8細胞增殖能力，降低透射電鏡觀察到細胞衰老形態(tài)學改變減輕，提升S期細胞率，降低G1期細胞，降低細胞凋亡率，提升胞內(nèi)SOD活力、降低ROS及MDA水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯減弱，細胞上清液中IL-2、TNF-α減少，IL-

15、6、SCF、GM-CSF、IL-1β水平升高，胞內(nèi)P53、P21、P16表達水平降低，CDK2、CDK4表達上升，cyclinD及cyclinE表達水平無明顯改變。
　　5. Rg1體外作用衰老BMSCs與 BMNCs共培養(yǎng)后，與衰老組BMNCs比較，SA-β-Gal染色陽性細胞率降低，CFU-Mix形成能力增強，CCK8檢測細胞增殖能力增強，細胞周期 G1期減少、S期增加，細胞凋亡率減少，胞內(nèi)SOD活力提升、ROS水平降低而MD

16、A水平無明顯改變，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯減弱。
　　6.衰老大鼠BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯增加、CCK8細胞增殖能力減弱、細胞周期S期細胞比例減少、G1期比例增加，凋亡率明顯增加，胞內(nèi)ROS、MDA水平升高SOD、GSH-Px水平降低、IL-2、TNF-α分泌水平減少、IL-6、SCF分泌水平增加，Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16增加，CDK2表達減少，而cyclinD水平無

17、明顯改變。
　　7.衰老大鼠BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯增加、CFU-Mix混合集落形成能力減弱、細胞周期S期細胞比例減少，G1期細胞比例增加，ROS水平增加、SOD活力降低、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達水平增加。
　　8. Rg1作用衰老大鼠后，體內(nèi)BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯減少、CCK8細胞增殖能力增加、細胞周期S期細胞比例增加、G1期比例降低，凋亡率明顯減少，

18、ROS、MDA水平減少，SOD活力增加但GSH-Px水平無明顯改變、IL-2、TNF-α分泌水平增加、IL-6、SCF水平減少，Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16表達減少，CDK2與cyclinD水平無明顯改變。
　　9.Rg1作用衰老大鼠后，體內(nèi)BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯減少、CFU-Mix混合集落形成能力增強、細胞周期S期細胞比例增加，G1期細胞比例減少，ROS水平減少、SOD活力增加、

19、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達明顯減少。
　　結論:
　　1.D-gal可以復制BMSCs衰老的體內(nèi)外模型。
　　2.衰老的BMSCs可誘導BMNCs衰老。
　　3.人參皂苷Rg1在體內(nèi)外均可拮抗D-gal對BMSCs的致衰作用，并通過以上途徑恢復BMNCs的造血能力。。
　　4.人參皂苷Rg1拮抗D-gal對BMSC的致衰作用可能與抑制氧化應激損傷、抑制炎性反應、下調(diào)衰老相關蛋白有關。