流感病毒寡核苷酸檢測芯片的初步研究.pdf

1、流行性感冒是一種由流感病毒引起的上呼吸道傳染病。流感極易在人群中傳播并造成大流行。歷史上每一次流感的大流行都會造成成千上萬人死亡。流感病毒分為甲、乙、丙三型，甲型流感又包含15個血凝素亞型和9個神經(jīng)氨酸酶亞型。其中，常引起人群發(fā)病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2以及乙型流感病毒。流感病毒基因?yàn)榉止?jié)段的單負(fù)鏈RNA，其中甲型和乙型包含8個RNA節(jié)段，丙型包含7個RNA節(jié)段，缺少神經(jīng)氨酸酶節(jié)段。在這8個RNA節(jié)段中，編碼核蛋白(nuc

2、leoprotein，NP)和膜蛋白(matrixprotein，MP)的節(jié)段具有型特異性，NP還是流感病毒分型的依據(jù)；甲型流感病毒中血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidases，NA)極易變異，具有亞型特異性，是甲型流感病毒亞型劃分的依據(jù)。 目前流感病毒的檢測方法主要有病毒分離法、血清學(xué)檢測、流感病毒抗原檢測和多重PCR檢測方法。無論是哪一種檢測方法，都無法同時對眾多型和亞型的流感病毒進(jìn)

3、行精確的分型。因而有必要尋找一種高效、高通量和快速的流感病毒檢測和分型方法?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)為同時對流感病毒進(jìn)行檢測和分型提供了可能的途徑。它可以同時對成千上萬個基因進(jìn)行檢測，因而是一種高通量、平行化的檢測方法。 基因芯片根據(jù)探針類型分為cDNA芯片，DNA芯片和寡核苷酸芯片，近年來的研究表明，寡核苷酸芯片比cDNA芯片和DNA芯片有著更高的特異性，同時其靈敏度也能滿足目前病原體檢測的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用芯片上原

4、位合成短的寡核苷酸探針的方法，也可以采用合成儀人工合成15～80mer的寡核苷酸探針然后固定在支持物上的方法制備。這兩種方法中，后者相對簡單易行，且系統(tǒng)的開放性較好。而在探針的長度的選擇上，60mer的寡核苷酸探針被認(rèn)為能取得特異性和靈敏度之間的平衡，并且多數(shù)情況下只需一個探針即可檢測一個基因。 本課題用oligo6.0軟件針對流感病毒的NP、MP、HA和NA基因設(shè)計(jì)了77條60mer的寡核苷酸探針。為了保證設(shè)計(jì)的探針具有高度的

5、特異性和靈敏度，設(shè)計(jì)時使探針Tm值在85±5℃之間，GC含量介于40％～60％，且探針內(nèi)部和探針之間不易形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。在Blast比對中，與其它基因的同源性小于70％，連續(xù)相同堿基的數(shù)量不超過18個。寡核苷酸探針合成和純化后，用芯片打印儀固定在玻片上。隨后，從省CDC取回的甲型流感病毒株H1N1、H3N2和乙型流感病毒株中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以限制性顯示(RestrictionDisplay,RD)技術(shù)進(jìn)行熒光標(biāo)記后與芯片雜交，并

6、根據(jù)雜交結(jié)果篩除與相應(yīng)本型流感病毒樣品的雜交信號的信噪比低于2，以及與其它型流感病毒樣品雜交的信噪比高于1.5的寡核苷酸探針，得到33條高靈敏度、高特異性的寡核苷酸探針。 為了提高芯片的特異性和靈敏度，我們還對標(biāo)記方法、片基和雜交條件等進(jìn)行優(yōu)化。 1.標(biāo)記方法的優(yōu)化本部分研究比較了通用引物聯(lián)合標(biāo)記(UniversalPrimerLabeling，UPL)、RD直接標(biāo)記、RD間接標(biāo)記和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記這四種方法的標(biāo)記效率

7、和可重復(fù)性，將流感病毒RNA分別用四種標(biāo)記方法處理后與流感病毒寡核苷酸檢測芯片雜交，用SPSS10.0對雜交結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明UPL方法在標(biāo)記物雜交的熒光強(qiáng)度、信噪比、探針真陽性率和可重復(fù)性等方面均高于隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄摻入標(biāo)記法，而與其它兩種RD標(biāo)記方法相當(dāng)，但標(biāo)記過程相對簡單。 2.片基的選擇本部分研究對Corning、多聚賴氨酸包被的DAKO玻片和多聚賴氨酸處理的顯微鏡載玻片這三種片基進(jìn)行了評估。將熒光標(biāo)記的綠色熒光蛋白(

8、greenfluorescentprotein，GFP)基因的寡核苷酸探針分別打印在這三種片基上，并按常規(guī)方法進(jìn)行洗脫，GenePix4100A掃描后用GenePix6.0軟件分析點(diǎn)的大小、熒光強(qiáng)度和背景熒光強(qiáng)度，以此來衡量3種片基的均一性和固定效率，并通過不同濃度梯度的60mer寡核苷酸探針的雜交實(shí)驗(yàn)來衡量片基對雜交效率的影響。結(jié)果顯示，3種片基的均一性都較好，而多聚賴氨酸包被的DAKO和Corning芯片的固定效率和雜交效率優(yōu)于國產(chǎn)

9、芯片。研究認(rèn)為多聚賴氨酸包被的DAKO片基性能優(yōu)異，價(jià)格便宜，適合于大規(guī)模的基因芯片研究。 3.優(yōu)化雜交溫度，雜交時間和雜交液等條件。結(jié)果表明，雜交溫度40℃，雜交時間4～8h，雜交液含30％甲酰胺，5×SSC和0.1％SDS為流感病毒寡核苷酸芯片最適的雜交條件。 4.質(zhì)控芯片的建立：為了監(jiān)測芯片檢測的過程中是否存在人為的操作失誤以及降低芯片檢測的假陽性率和假陰性率，研究中設(shè)計(jì)GFP寡核苷酸探針為陽性對照探針，并構(gòu)建了克

10、隆有GFP基因的克隆載體G-T和體外轉(zhuǎn)錄載體G-S，以提供可摻入到DNA或者RNA樣品中與之一起標(biāo)記的陽性對照品。該研究針對GFP基因設(shè)計(jì)的4條60mer寡核苷酸探針和1條陽性對照探針通用引物串聯(lián)序列與流感病毒寡核苷酸探針一起打印在DAKO玻片上，并構(gòu)建了GFP基因的克隆載體和體外表達(dá)載體，將從這兩種重組載體上獲得的GFP基因的RNA、DNA片段和人全血樣品中的DNA用RD技術(shù)擴(kuò)增標(biāo)記，將標(biāo)記的樣品和熒光標(biāo)記的通用引物分別與芯片雜交，用

11、GenePix4000B掃描熒光信號后并用SPSS11.0對掃描的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，GFP基因探針與相應(yīng)的樣品雜交時出現(xiàn)陽性信號，陽性對照探針在所有的雜交中均出現(xiàn)陽性信號，而空白對照則未檢測熒光信號。因而建立的質(zhì)控系統(tǒng)具有較好的敏感性和特異性，可以用于基因芯片中的質(zhì)量監(jiān)控，為芯片的檢驗(yàn)過程提供了一種有效的質(zhì)控方法。 5.臨床樣品的檢驗(yàn)研究。研究中應(yīng)用流感病毒寡核苷酸檢測芯片對21例具有流感樣癥狀患者的咽漱液樣品進(jìn)行了檢

12、測。其方法是，從咽漱液樣品中抽提出病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用RD標(biāo)記使樣品標(biāo)上熒光物質(zhì)，然后與包含有實(shí)驗(yàn)中篩選出的33條高靈敏度、高特異性的流感病毒寡核苷酸探針，4條GFP基因陽性對照探針和5條蟲熒光素酶基因探針的芯片進(jìn)行雜交，芯片洗脫、掃描后采用GenePixPro6.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。同時實(shí)驗(yàn)中分別針對這三種流感病毒的NP、MP、HA和NA設(shè)計(jì)了10對引物，通過4組多重逆轉(zhuǎn)錄PCR對臨床樣品進(jìn)行鑒定，并與芯片的檢測結(jié)果相對照。雜交結(jié)果

13、表明，芯片的特異性和靈敏度均較高，陰性對照和陽性對照在芯片上均發(fā)揮著較為可靠的監(jiān)測功能。在這21例樣品中，H1N1有5例，而H3N2和乙型流感各1例。與多重逆轉(zhuǎn)錄PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 綜上所述，本研究自行設(shè)計(jì)制備了流感病毒寡核苷酸芯片，并用于實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和臨床樣品的檢驗(yàn)。結(jié)果表明，流感病毒寡核苷酸芯片的特異性和靈敏度均較好，檢驗(yàn)型基因芯片為臨床流感病毒寡核苷酸檢測芯片的研制提供了基礎(chǔ)，可望對早期流感流行的快速診斷和預(yù)防做出