酵母全細(xì)胞不對(duì)稱還原法合成光學(xué)純?chǔ)?羥基酸及其脫氫酶特性的研究.pdf

1、生物催化以其高效的立體、位置和化學(xué)選擇性成為合成光學(xué)純手性化合物的重要手段。光學(xué)純?chǔ)?羥基酸類手性砌塊是重要的精細(xì)化工中間體和手性藥物前體。(R)-扁桃酸結(jié)構(gòu)單元是其中最具有應(yīng)用價(jià)值的代表,它不僅是半合成青霉素、頭孢菌素、減肥藥物和抗腫瘤藥物等多種手性藥物的重要砌塊,還是應(yīng)用廣泛的手性拆分劑。微生物不對(duì)稱還原途徑以其理論產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)便成為合成此類化合物最直接和可行的方法。但目前仍存在催化劑穩(wěn)定性差、全細(xì)胞傳質(zhì)阻力和終產(chǎn)物濃度低等問題。

2、本論文以(R)-扁桃酸為模型產(chǎn)物,以克服生物催化反應(yīng)中的主要限制因素、提高生物催化效率為目標(biāo),通過生物催化劑篩選、合理設(shè)計(jì)生物催化過程、對(duì)底物進(jìn)行修飾和采取原位分離策略等方法使微生物不對(duì)稱還原潛手性化合物合成(R)-扁桃酸類結(jié)構(gòu)單元的效率明顯提高。此外,對(duì)全細(xì)胞催化劑內(nèi)起關(guān)鍵作用的醇脫氫酶進(jìn)行了純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,為其應(yīng)用和進(jìn)一步改造提供指導(dǎo)。主要結(jié)果如下:
　　 (1)以苯甲酰甲酸為模型α-酮酸底物,針對(duì)底物極性和酸性導(dǎo)致的生

3、物催化劑穩(wěn)定性差的問題,采取逐步提高底物濃度的連續(xù)分批選擇方法獲得了具有較好操作穩(wěn)定性的全細(xì)胞催化劑葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus GIM2.105)。該催化劑在連續(xù)分批轉(zhuǎn)化20批后仍具有較高的催化活性,4℃儲(chǔ)存5周對(duì)催化劑的活性影響很小。對(duì)此催化劑的底物特異性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)它對(duì)4種苯甲酰甲酸的苯環(huán)取代衍生物也具有很好的催化效果,產(chǎn)物(R)-扁桃酸衍生物的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體過量值(ee值)分別保持在90％

4、和95％以上。
　　 (2)利用硫酸銨鹽析、苯基疏水層析和凝膠過濾等純化了S.ellipsoideus胞內(nèi)D-扁桃酸脫氫酶,純化倍數(shù)為46倍。該酶的亞基分子量為44 kDa,催化還原反應(yīng)的最佳輔酶是NADPH,這些性質(zhì)與其他來源的D-扁桃酸脫氫酶不同。S.ellipsoideus D-扁桃酸脫氫酶催化還原反應(yīng)的最適pH和溫度分別為pH5.5和30℃,在pH5.5-pH8.0和溫度低于30℃時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定。
　　 (3)研

5、究了影響S.ellipsoideus全細(xì)胞不對(duì)稱還原苯甲酰甲酸的主要因素,確定最適反應(yīng)條件為:限氧條件下、pH7.5、溫度35℃、葡萄糖作為輔助底物、其最適濃度是10 g/L。在此條件下,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化48 h后,產(chǎn)物(R)-扁桃酸的轉(zhuǎn)化率和ee值分別達(dá)到90％和99％以上。在監(jiān)測(cè)S.ellipsoideus不對(duì)稱還原苯甲酰甲酸的進(jìn)程時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化初期12 h無產(chǎn)物生成,即存在轉(zhuǎn)化初期停滯現(xiàn)象。通過研究關(guān)鍵醇脫氫酶活

6、性、輔助底物和全細(xì)胞催化劑的傳質(zhì)阻力等影響因素,確定全細(xì)胞對(duì)底物/產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力是導(dǎo)致此反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的原因。通過改變底物結(jié)構(gòu),即將原α-酮酸底物變?yōu)棣?酮酯底物,可以使不對(duì)稱還原反應(yīng)的時(shí)間明顯降低。
　　 (4)通過篩選更適合催化α-酮酯底物不對(duì)稱還原的生物催化劑以及合理設(shè)計(jì)反應(yīng)過程進(jìn)一步提高了此類化合物的生物合成效率。以苯甲酰甲酸甲酯為模型α-酮酯底物,通過對(duì)反應(yīng)特異性限制因素(如底物和產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性等)的研究,發(fā)現(xiàn)底物和產(chǎn)物

7、的水解是此反應(yīng)的主要限制因素。通過初步選擇生物催化體系的pH值將底物和產(chǎn)物的水解損失降至最低。在此較適pH值下,對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的37株酵母菌進(jìn)行篩選,獲得了對(duì)底物苯甲酰甲酸甲酯具有較高催化活性和立體選擇性的全細(xì)胞催化劑釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae.AS2.1392)。研究了其催化不對(duì)稱還原α-酮酯的主要影響因素,確定最適轉(zhuǎn)化條件為:pH6.5、溫度25℃、葡萄糖作為輔助底物、其最適濃度是20 g/L。在此條件

8、下,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時(shí),反應(yīng)在1.5 h之內(nèi)結(jié)束,產(chǎn)物(R)-扁桃酸甲酯的產(chǎn)率和ee值分別達(dá)到92.4％和95％。
　　 (5)研究了底物和產(chǎn)物濃度對(duì)S.cerevisiae全細(xì)胞不對(duì)稱還原α-酮酯的影響,建立了底物和產(chǎn)物抑制模型。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?3 mmol/L時(shí)反應(yīng)初速度最大,隨著底物濃度的升高或降低反應(yīng)初速度降低;產(chǎn)物濃度的增加使反應(yīng)初速度呈下降趨勢(shì),當(dāng)產(chǎn)物濃度高于100 mmol/L時(shí),反應(yīng)初速度迅速下降。為