蘇丹紅I免疫原的制備及其免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、蘇丹紅Ⅰ（SudanI）即1-苯基偶氮-2-萘酚，是一種人工合成的脂溶性化工染料，并被證明是一種潛在的致癌物質(zhì)，禁止作為食品染料添加在食品中。2003年5月，法國(guó)從印度進(jìn)口的紅辣椒粉中檢出蘇丹紅Ⅰ，對(duì)此發(fā)出緊急通知。在中國(guó)，2005年2月至5月蘇丹紅Ⅰ不斷在各種食品中檢出，比如：雞腿、漢堡、辣泡菜和辣椒醬等，引起人們消費(fèi)恐慌。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和國(guó)家的重視，其檢測(cè)方法也不斷發(fā)展。目前已有電化學(xué)分析法、光譜法、色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技

2、術(shù)、免疫分析技術(shù)等檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）是一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的分析方法，具備靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，己廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物分析、食品分析和環(huán)境分析等領(lǐng)域中。為了建立快速、靈敏的蘇丹紅Ⅰ殘留免疫學(xué)分析方法，本研究在分析蘇丹紅Ⅰ免疫學(xué)特性的基礎(chǔ)上，采用單克隆抗體技術(shù)制備了蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體，并組裝了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴重氮化法合成蘇丹紅Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似物（CSDI），以活性

3、酯法將 CSDI與載體蛋白偶聯(lián)，制備BSA-CSDI免疫抗原與OVA-CSDI。并用紫外掃描（UV）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行鑒定。用 SudanI人工免疫抗原（BSA-SudanI）免疫BALB/c小鼠。間接ELISA測(cè)定多抗血清效價(jià)，阻斷ELISA鑒定其抑制價(jià)。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示：3只小鼠血清效價(jià)均達(dá)到了1×1.28-4，且3號(hào)小鼠多抗血清抗SudanI的IC50為67ng/mL，表明成功獲得了高效價(jià)、特異性好、

4、親和力較高的鼠源抗 SudanI多抗血清，為 SudanI殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。⑵間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法選擇細(xì)胞融合備用鼠；運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體（SudanImAb），并對(duì)單克隆抗體的效價(jià)、親和力、敏感性、特異性和亞型進(jìn)行鑒定；體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。篩選出了6H6B1、6H6E6、6H6G10、6F12E2、6F12E5和6F12G2六株敏感特異的雜交瘤細(xì)胞；鑒定單抗亞型均為I

5、gG1；細(xì)胞培養(yǎng)上清間接 ELISA效價(jià)在1:6.4×102～1:1.28×103之間，6H6E6細(xì)胞株制作的腹水效價(jià)為1:6.6×105，蘇丹紅ImAb親和常數(shù)(Ka)為1.85×1010L/moL和1.94×1010L/moL，對(duì)蘇丹紅Ⅰ的 IC50為2ng/mL；與其它標(biāo)準(zhǔn)品無交叉反應(yīng)。通過試驗(yàn)獲得了高效價(jià)、敏感、特異的蘇丹紅ImAb，可用于動(dòng)物性食品中蘇丹紅Ⅰ的殘留檢測(cè)的免疫學(xué)試驗(yàn)。⑶根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理，應(yīng)用蘇丹紅ImAb