動(dòng)物源性食品中各種動(dòng)物源性肉及肉制品鑒別檢驗(yàn)的研究.pdf

1、近年來,動(dòng)物源性食品摻假、過分添加各種添加劑、使用非食用性原料和成分等各種食品安全問題不斷出現(xiàn)。因此,建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,對(duì)食品進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的問題。本試驗(yàn)開展了多重PCR技術(shù)鑒別檢測(cè)肉食品中動(dòng)物源性成分的研究,通過分子生物學(xué)手段,研究各類動(dòng)物源性肉及肉制品的特異性基因,借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特性,來達(dá)到對(duì)相應(yīng)的動(dòng)物源性肉及肉制品定性和定量檢測(cè)的目的。
　　 用KI法、氯仿-醋酸鈉法、酚仿抽提法、試

2、劑盒法和FTA濾膜法5種提取方法分別對(duì)新鮮動(dòng)物組織進(jìn)行基因組DNA提取,通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所獲基因組DNA均呈現(xiàn)亮帶,背景清晰,電泳條帶整齊均勻,完整性好。用同等樣品,KI法和氯仿-NaAe法提取效果最好,試劑盒法次之。紫外分光光度計(jì)所測(cè)OD260nm/OD280nm值在1.70～1.93,濃度為0.1～2.0μg/μL,提取的DNA無RNA和蛋白質(zhì)或酚的污染。
　　 試驗(yàn)過程中通過對(duì)TaqDNA聚合酶、dNTPs濃度

3、、Mg2+濃度、引物、循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化,確定了PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。鴨和豬(引物1)單重PCR反應(yīng)體系為:預(yù)混液25μL,引物終濃度為0.2μmol/L,模板0.5μg,用ddH2O補(bǔ)足體系50μL。鴨成分PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,56℃退火40s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸5min。豬成分PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性1min;94℃變性60s,54℃退

4、火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。鴨肉DNA擴(kuò)增后在226bp位置有明亮條帶,豬肉DNA擴(kuò)增后在149bp位置有明顯亮帶,與預(yù)期目的條帶大小一致,空白對(duì)照無條帶產(chǎn)生,無非特異條帶。KI法最低檢出限為0.005%,氯仿-NaAc法檢出限為0.01%,試劑盒法檢出限為0.1%.
　　 鴨和豬(引物1)雙重PCR反應(yīng)體系為:預(yù)混液25μL,鴨引物各2μL,豬1引物各0.5μL(引物濃度為20μmol/L),鴨

5、模板1μg,豬模板0.5μg,用ddH2O補(bǔ)足體系50μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min94℃變性30s,56℃退火40s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。結(jié)果可同時(shí)擴(kuò)增出兩個(gè)清晰條帶,位置與目的條帶一致。
　　 用牛、山羊、綿羊、豬、雞、馬、鹿、兔8種動(dòng)物相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,從不同物種擴(kuò)增得到片段大小各不相同的PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系為:預(yù)混液25μL,混合引物6.5μL,模板0.5μg

6、,用ddH2O補(bǔ)足體系至50μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,58℃左右退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸4min。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),當(dāng)引物的混合比例為通用上游:牛:山羊:綿羊:豬2:雞:馬:鹿:兔=1:2:3:0.5:1:0.6:2:1.5:1.8(1代表20pmol/50μL)時(shí),擴(kuò)增效果最為理想。此方法能同時(shí)擴(kuò)增出8種動(dòng)物的特異性條帶,檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01%.
　　 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)