美達霉素生物合成途徑中的新型轉錄調控因子Med-ORF10的作用機制初步研究.pdf

1、美達霉素是由包括鏈霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)在內的多個鏈霉菌積累的抗生素,具有抗菌和抗癌活性,可以作為多種腫瘤細胞的信號轉導抑制劑。美達霉素生物合成基因簇中的med-ORF10是美達霉素生物合成途徑中的一個功能未知基因。因為其同源基因在多個抗生素基因簇中都存在,所以推測med-ORF10及同源基因在相應抗生素合成途徑中都是必須基因,可能調控抗生素的生物合成。
　　 本研究以美達霉素生物合

2、成基因簇中的新型轉錄調節(jié)基因(med-ORF10)為研究對象,綜合運用遺傳學、分子生物學和分析化學等相關研究方法,通過體外和體內實驗確定med-ORF10的功能,并對其作用機制展開初步研究,具體內容如下:
　　 1.體內遺傳學實驗證明med-ORF10具有調控功能將含有基因med-ORF10的鏈霉菌自主復制型質粒pHSL98經原生質體轉化導入美達霉素產生菌-鏈霉菌AM-7161中進行超量表達(Overexpression)；對超

3、量表達菌株AM-7161／pHSL98進行發(fā)酵液及R4平板菌落產素(暗示美達霉素的積累)顏色觀察,初步推斷med-ORF10的超量表達可以促進產素；然后通過對AM-7161／pHSL98發(fā)酵液進行LC／MS檢測,發(fā)現(xiàn)基因med-ORF10的導入和過量表達使發(fā)酵上清中美達霉素產量增加大約2.3倍(并且一個中間產物的量也增加了大約6倍)。這表明med-ORF10可能是正效調控基因。
　　 2.通過RT-PCR初步確定在美達霉素基因簇

4、中受med-ORF10調控的靶基因提取美達霉素“異源野生菌株”CH999／pIK340和“異源突變菌株”CH999／pAYT64的總RNA,以看家基因23 S rRNA基因為內參,利用半定量RT-PCR檢測兩個菌株中美達霉素基因簇中med-ORF12、med-ORF1、med-ORF11等基因的轉錄水平,發(fā)現(xiàn)在“異源野生菌株”和“異源突變菌株”兩菌株中,這些基因轉錄水平存在差異,說明這幾個基因的轉錄分別在不同程度上受到med-ORF10

5、的調控；而且“異源突變菌株”中med-ORF10的缺失使這些靶基因的轉錄水平不同程度的提高。
　　 本實驗初步確定在異源表達體系中受到med-ORF10調控的靶基因。
　　 3.med-ORF10與靶基因啟動子的關系初步研究首先構建了在美達霉素產生菌-野生型鏈霉菌AM-7161-中進行啟動子活性檢測的陽性對照系統(tǒng):將已知功能的鏈霉菌啟動子PactⅢ克隆到啟動子探針載體pIJ8660的EGFP基因上游；通過原生質體轉化導入

6、野生型鏈霉菌AM-7161；熒光顯微鏡檢測到EGFP綠色熒光,說明這套啟動子檢測系統(tǒng)在AM-7161菌株中是適用的。
　　 利用生物信息學軟件分析預測了美達霉素基因簇中幾個靶基因上游的啟動子；對主要的靶基因med-ORF12上游的可能的啟動子進行了克隆和測序,并進一步插入到啟動子探針載體pIJ8660的EGFP基因上游,將獲得的質粒pHSL33導入美達霉素產生菌AM-7161(野生菌株)中。
　　 以上研究結果初步確定了