抗細(xì)菌muraymycin生物合成的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、Muraymycin是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)位酶抑制因子，在細(xì)胞內(nèi)的靶位點(diǎn)是肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)位酶(MraY)，因此有較強(qiáng)的抗G+細(xì)菌的作用。其抗菌譜窄，有與現(xiàn)有藥物不同的靶位點(diǎn)，作用機(jī)制獨(dú)特，目前臨床上尚沒(méi)有MraY抑制劑在使用，所以此類抗生素與現(xiàn)用的抗生素不會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥。因此，muraymycin等尿苷肽類抗生素是尋找新型低毒，窄譜抗菌藥物先導(dǎo)化合物的最佳選擇。Muraymycin最初發(fā)現(xiàn)于2001年，具有相似結(jié)構(gòu)的抗生素有pacidamyc

2、in、caprazamycin、sansanmycin、napsamycin等，2011年其生物合成基因簇被克隆得到。
　　本研究從不同水平上對(duì)與muraymycin生物合成相關(guān)的調(diào)控基因mur34、mur33、mur32的功能進(jìn)行了探索研究。首先，通過(guò)PCR-Targeting技術(shù)在同源載體上將mur34與mur32進(jìn)行基因失活。將mur34突變失活后的pJTU5642載體接合轉(zhuǎn)至Streptomyces lividans TK

3、24宿主中后，成功實(shí)現(xiàn)了muraymycin基因簇的異源表達(dá)。通過(guò)對(duì)pJTU5030上基因簇邊界基因進(jìn)行失活，確定了抗生素生物合成的最小基因組為mur12到mur33的大片段。染色體基因組上mur34的失活直接導(dǎo)致了菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性及muraymycin產(chǎn)量的提高，對(duì)突變株進(jìn)行基因回補(bǔ)后恢復(fù)了菌株的野生型表型。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相對(duì)轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)mur34突變后基因簇的轉(zhuǎn)錄提高了30多倍。經(jīng)測(cè)定分析mur33與

4、mur32組成一個(gè)操縱子，利用5'RACE技術(shù)證實(shí)mur33-mur32啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游58個(gè)堿基處。然后，在原核宿主BL21(DE3)中對(duì)Mur34進(jìn)行了His標(biāo)簽融合的蛋白表達(dá)，并利用親和層析技術(shù)進(jìn)行蛋白的制備。通過(guò)凝膠遷移試驗(yàn)以及DNaseⅠ足跡試驗(yàn)，測(cè)定了Mur34與muraymycin基因簇上各啟動(dòng)子DNA的體外結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)Mur34特異性的結(jié)合在mur33起始密碼子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)中間區(qū)域，暗示了Mur

5、34通過(guò)阻止RNA聚合酶復(fù)合物的遷移而抑制mur33-mur32操縱子的轉(zhuǎn)錄。利用兒茶酚-2，3-雙加氧酶活性對(duì)野生型及突變型啟動(dòng)子的活性進(jìn)行檢測(cè)，再次證實(shí)Mur34對(duì)mur33-mur32的轉(zhuǎn)錄抑制作用，同時(shí)確定了-10區(qū)相對(duì)于-35區(qū)對(duì)啟動(dòng)子發(fā)揮功能的重要性。另外，對(duì)mur32突變株進(jìn)行發(fā)酵液的抑菌活性、LC-MS以及熒光定量PCR檢測(cè)等試驗(yàn)，確定mur32的突變對(duì)muraymycin的生物合成幾乎沒(méi)有影響。
　　經(jīng)信息學(xué)分析

6、發(fā)現(xiàn)，Mur33與SsaA的C端DNA結(jié)合域有較高的相似性，是一個(gè)調(diào)控因子。利用高保真PCR技術(shù)擴(kuò)增mur33核酸序列的左右同源臂，經(jīng)酶切后連至pOJ446載體上，構(gòu)建成基因的同框缺失載體pJTU5020，將其通過(guò)屬間接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至muraymycin野生型產(chǎn)生菌S.sp.NRRL30471，經(jīng)過(guò)染色體同源雙交換后獲得mur33在染色體上的同框缺失突變。對(duì)Mur33突變株的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性和LC-MS檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)mur33突變后菌株對(duì)

7、枯草芽孢桿菌的抑制活性降低，幾乎失去了muraymycin的產(chǎn)生能力。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mur33突變后基因簇的轉(zhuǎn)錄水平大幅度降低。另外，對(duì)mur33突變株進(jìn)行基因回補(bǔ)后恢復(fù)了菌株的野生型表型。
　　構(gòu)建mur33的NusA融合蛋白載體，并用自誘導(dǎo)型培養(yǎng)基ZYM5052對(duì)蛋白表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，成功獲得了Mur33的可溶性表達(dá)。同時(shí)設(shè)置2個(gè)負(fù)對(duì)照(NusA標(biāo)簽和空載菌株蛋白)，以及非特異性poly dI-dC和

8、競(jìng)爭(zhēng)性探針，對(duì)Mur33融合蛋白與啟動(dòng)子DNA的體外結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與mur12-mur31啟動(dòng)子DNA有較高的結(jié)合活性，而muraymycin生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都受控于mur12-mur31啟動(dòng)子。因此，確定Mur33作為關(guān)鍵的正調(diào)控因子激活muraymycin的生物合成。
　　綜上，在muraymycin生物合成的途經(jīng)特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Mur34接受上游調(diào)控因子傳來(lái)的信號(hào)，通過(guò)阻止必需的正調(diào)控因子Mur33的轉(zhuǎn)