維生素D對ECM免疫調節(jié)效應及其機制的研究.pdf

1、實驗目的
　　瘧疾廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，每年造成300多萬人感染，并導致60多萬人死亡。腦型瘧疾(CM)是惡性瘧原蟲感染最嚴重的并發(fā)癥，且是5歲以下兒童死亡的主要原因。導致人類CM發(fā)生的機制尚不十分清楚，瘧原蟲寄生的紅細胞(PRBCs)粘附至腦血管內皮細胞引起腦微血管機械性梗阻被認為是導致CM的病理機制。此外，以高水平炎性細胞因子為特點的過度炎癥反應也被認為有助于CM的發(fā)生。炎性細胞因子上調腦血管內皮細胞黏附分子如ICAM-

2、I和VCAM-1的表達，進一步增強細胞粘附和PRBCs在大腦的沉積。更好地了解CM的發(fā)生機制和明確CM有效的輔助治療策略是亟待解決的重要課題。
　　伯氏瘧原蟲（PlasmodiumbergheiANKA，P.bANKA）感染的鼠瘧模型疾病過程與P.f瘧疾感染的臨床表現(xiàn)有許多共同之處，是研究人類瘧疾疾病的最佳模型。研究表明，CM是腦血管內感染紅細胞(parasitizedredbloodcells，pRBC)的黏附和細胞因子與效應細

3、胞介導的宿主強烈前炎癥應答的綜合效應。相關研究表明活化T細胞介導的免疫應答參與疾病誘導，并且CD4+T細胞和CD8+T細胞均有利于腦病變發(fā)生。事實上，Th1型免疫應答在控制蟲血癥方面發(fā)揮關鍵作用的同時也促進CM發(fā)生。
　　維生素D(Cholecalciferol，VD)是一種脂溶性維生素，暴露于紫外線或添加飲食后由皮膚合成。VD除了其經(jīng)典的調節(jié)骨和鈣磷代謝，在先天免疫和適應性免疫系統(tǒng)也有明顯的調節(jié)功能。VD的免疫調節(jié)功能，特別是對

4、Th1型反應的抑制作用，促使我們進一步研究VD在實驗性腦型瘧疾(ECM)中的作用。在嚙齒類動物瘧疾模型中，有報道表明在伯氏瘧原蟲感染小鼠之前口服給予VD預防性治療兩周，可以降低小鼠感染率和延長生存期。然而，最近的一項研究表明，每周三次腹腔注射0.5μg/kgVD，對感染PbA的野生型小鼠沒有影響。為此，我們系統(tǒng)地研究了VD對ECM模型（P.bANKA感染C57BL/6小鼠）的免疫調節(jié)效應及其相關機制，旨在為瘧疾的有效防治提供新的理論依據(jù)

5、。
　　實驗方法
　　1、收集患者血清
　　從緬甸東北部村莊采集56個無瘧疾感染并發(fā)癥的發(fā)熱病人（27例惡性瘧和29例間日瘧）。此外，10名健康志愿者作為對照組。獲得書面同意后，用內壁覆有EDTA的真空采血管采集每個志愿者1ml的靜脈血。將血液以1000×g，5分鐘離心，收集血清，將其貯存在-80℃待檢測VD。根據(jù)制造商的說明，使用25(OH)D3的ELISA試劑盒(ImmundiagnostikAG,Bensheim

6、，Germany)，測定每個志愿者血清中的25(OH)D3的水平。樣品重復測定，取平均值。
　　2、實驗動物處理、感染及原蟲血癥觀察
　　VD處理:C57BL/6小鼠隨機分為6組:正常小鼠未感染(uninfected)，兩個PbA感染對照組(PbA)，PbA感染前補充VD組(VD+PbA)，PbA感染后補充VD組(PbA+VD)，和正常小鼠未感染，但給予VD治療作對照。VD+PbA組小鼠在PbA感染之前連續(xù)4天，每日灌胃給予

7、VD(50μg/kg)，而PbA+VD組小鼠在PbA感染48h之后開始連續(xù)4天，每日灌胃給予VD(10μg/kg、50μg/kg、250μg/kg)。兩對照組在VD+PbA和PbA+VD給藥的相同時間點給予相同體積的大豆油作為對照。在感染的第5天，收集血清，并使用25(OH)D3的ELISA試劑盒檢測25(OH)D3的含量。
　　小鼠感染:經(jīng)腹腔感染1×106P.bANKA寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，

8、制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率。
　　3、小鼠血腦屏障通透性檢測
　　(1)于小鼠感染后第5天將各組小鼠靜脈注射200μl2％伊文思藍染料(2％Evansbluedye，EB，sigma公司)。
　　(2)1h后，心臟灌注生理鹽水至流出清亮液體為準，然后取腦，拍照。
　　(3)將各組小鼠的腦放入離心管中，管內加入1ml甲酰胺（sigma公司），37℃孵育48h。
　　(4)將各管取出，3

9、000rpm離心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。
　　(5)630nm檢測OD值。
　　4、HE染色和免疫組化
　　PbA感染后第5天開始出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，對每個實驗組的五只小鼠進行組織學檢查。用×400顯微鏡觀察ICAM-1，VCAM-1-，和CD36陽性血管，計數(shù)每只小鼠20個視野陽性血管的數(shù)量。小鼠大腦被固定在4％多聚甲醛中，然后石蠟包埋和切片，免疫組化(IHC)方法如下:
　　(1)石蠟切片，

10、常規(guī)脫蠟脫水。
　　(2)3％H2O2（無色液體）室溫孵育10分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。
　　(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
　　(4)抗原修復:枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復方法。自然冷卻，再用PBS3分鐘×3次。
　　(5)血清封閉:37℃孵育30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
　　(6)滴加適當比例稀釋的一抗，4℃過夜（最好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(7)滴加生物素

11、標記的二抗，室溫或37℃孵育1小時。
　　(8)PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(9)滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘。
　　(10)PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(11)顯色劑顯色（DAB等）。
　　(12)自來水充分沖洗終止顯色。
　　(13)可進行復染，脫水，透明。
　　(14)封片劑封片。
　　5、Real-timeRT-PCR
　　腦組織Tot

12、alRNA的提取及反轉錄:用Trizol按照說明書提取腦組織RNA，然后使用分光光度計測定濃度。用PrimeScriptTMRT試劑盒（Takara公司）去除基因組DNA，將RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系為10μl，含有PrimeScriptTM緩沖液，PrimeScriptTMRT酶混合物，oligodT引物(50μM)和隨機引物兩種(100μM)及500ng總RNA。Real-time反應:用得到的cDNA作為模板和特定引物進行

13、PCR反應。使用SYBR(R)PremixExTaqTM試劑盒在ABI7500(ABI，USA)機器上進行定量PCR（Takara公司）。反應條件如下:95℃預變性30秒，40個PCR循環(huán)（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化VD處理組與對照組的相對基因表達。
　　6、脾細胞培養(yǎng)
　　無菌取出感后第0、3、5天小鼠脾臟，用10％FCS-RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，1500rpm離心10min，用0.17

14、MNH4Cl裂解紅細胞，RPMI1640洗滌兩次。以含10％FCS-RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×107/ml，于24孔培養(yǎng)板中加入細胞懸液，500μl/孔，每組設2個復孔。于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ、TNF和IL-10檢測。
　　7、ELISA檢測
　　用ELISA試劑盒分別檢測血清和脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶標儀測定4

15、50nm處OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進行，結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應用SoftMaxPro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　8、流式細胞術
　　脾臟流式細胞術:
　　無菌取出感染前（第0天）和感染后第3、5天小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17mol/LNH4C1裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×107/ml。DCs檢

16、測:每份樣品用抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗、抗CD45R/B220-PerCP單抗和抗MHCⅡ-APC單抗進行四色分析，另設陰性對照管，在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗和抗CD45R/B220-PerCP單抗進行表面染色，離心去上清后，用0.5mlPBS重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。TLR9檢測:每份樣品應用F

17、ITC標記的抗小鼠CD11c單抗和Biotin標記的抗小鼠TLR9單抗進行雙色分析，另設單標CD11c單抗和TLR9單抗對照管。每管預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體2μl。然后用抗CD11c-FITC單抗進行表面染色，4℃30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。然后加入固定透膜夜250μl，4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液，1500rpm離心5min洗滌1次，棄上清。加入

18、抗-TLR9-BiotinmAb進行胞內標記，4℃孵育30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。加入抗-Streptavidin-PE進行胞內標記，4℃孵育30min。洗滌兩次，每管加入200μl2％多聚甲醛固定液重懸，流式細胞儀進行檢測。TLR4檢測:每份樣品用抗CD11c-FITC單抗和抗TLR4-PE單抗雙色分析，另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色

19、管中加入脾細胞懸液0.1ml，離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。Th1檢測:每份樣品預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC單克隆抗體，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE單克隆抗體，染色30分鐘。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。Tregs檢測:每份樣品用抗CD4-

20、FITC和抗CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進行胞內染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5mlPBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　腦組織流式細胞術:
　　將小鼠處死，取出腦，用150目篩網(wǎng)研磨腦。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中，42℃水浴45分鐘。300g離心10min，收集細胞沉淀，用30％Percoll重懸沉淀，然后加入到70％Perco

21、ll上層（用PBS配制），515g室溫離心30min。收集中間層，加入10mlPBS300g離心10min，然后標記相應的抗體:FITC-CD4、PerCP-CD8和APC-CD3。4℃染色30min，PBS洗滌細胞兩次，上機檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析。
　　9、統(tǒng)計學分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗比較分析組內和組間均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進行生存期分析。P＜0

22、.05為顯著差異。
　　實驗結果
　　1、VD處理顯著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D3水平
　　在感染后的第5天，正常對照組小鼠和PbA感染的小鼠VD水平相同。與未處理PbA感染組比較，兩個VD治療組25(OH)D3水平均顯著增高。我們還比較了健康人和瘧疾感染者血清中25(OH)D3水平。個體之間VD水平差別很大。健康人與急性惡性瘧和間日瘧患者25(OH)D3的均值(Kruskal-Wal

23、lisx2=3.13;P=0.2086)和平均對數(shù)轉換值(F=0.336;P=0.7160)沒有顯著差異。瘧疾患者血清25(OH)D3水平與健康對照組比較，無統(tǒng)計學差異。
　　2、VD處理顯著防止P.bANKA感染C57BL/6小鼠CM的發(fā)生
　　對照組小鼠在感染后第5-6天開始出現(xiàn)明顯的腦瘧癥狀（如抽搐，皮毛豎起，顫抖，肢體癱瘓，痙攣，昏迷等神經(jīng)學癥狀），第6-7天小鼠開始死亡，在第11天全部老鼠死亡。對照組死亡的小鼠原蟲

24、血癥水平相對較低(＜12％)。給予大豆油的PbA感染組小鼠和未經(jīng)處理的感染對照組有相同的癥狀（病理學，生存期，或原蟲血癥）。PbA感染前或后給予VD(50μg/kg)治療均減少早期死亡率而且所有VD治療的小鼠存活時間超過感染后11天。相反，VD(50μg/kg)治療組小鼠在感染3周后因貧血和原蟲血癥死亡。出入意料的是，感染后補充VD有一個優(yōu)勢，PbA+VD組小鼠存活時間長于VD+PbA組。此外，PbA+VD組小鼠原蟲血癥水平低于VD+P

25、bA組。因此，我們對PbA+VD組的病理和免疫學進行進一步的分析。
　　3、VD處理顯著改善實驗性腦瘧的病理改變
　　在小鼠感染后第5天，當小鼠出現(xiàn)腦瘧癥狀時取腦。與正常小鼠相比，組織學檢查顯示，PbA+VD組顯微鏡下每個視野白細胞沉積的血管數(shù)明顯低于對照組。免疫組化發(fā)現(xiàn)，PbA+VD組微血管內皮細胞表達的VCAM-1，ICAM-1和CD36明顯少于對照組。同時，PbA組血腦屏障的完整性破壞明顯，有較高水平的EB外滲。相比之

26、下，VD治療明顯減少腦組織的EB滲出。
　　4、VD處理顯著減少T細胞向腦組織遷移
　　在小鼠感染后第5天，分離腦單核細胞并檢測CD8+和CD4+T細胞的量。與未感染的正常小鼠相比，PbA感染CD8+和CD4+T細胞的量顯著增多。與此相反，PbA感染后VD治療組小鼠腦T細胞群的數(shù)量與未感染正常小鼠比較沒有顯著差異。為此，我們還對VD治療組和對照組腦組織CXCL9和CXCL10的mRNA表達進行比較。在感染后第5天，VD治療顯

27、著降低腦組織中趨化因子的表達。
　　5、VD抑制Th1細胞免疫應答
　　PbA感染小鼠第5天血清中IFN-γ和TNF水平顯著增加，脾細胞培養(yǎng)上清中的這些細胞因子也顯著增加。而VD治療組血清和脾細胞培養(yǎng)上清中的這兩種細胞因子水平明顯降低。此外，與對照組比較，VD治療組小鼠在感染后第5天腦組織中IFN-γ和TNF的mRNA表達顯著降低。同時，與感染前相比，對照組Th1型細胞（CD4+T-bet+IFN-γ+細胞）的數(shù)量在感染后第

28、3、5天顯著升高。然而，在感染后第5天，VD治療組小鼠脾細胞中Th1型細胞所占比例明顯降低。
　　6、VD處理提高Tregs數(shù)量并增加IL-10分泌
　　在小鼠感染后第3天，與對照組比較，PbA+VD組Tregs的數(shù)量顯著升高。此外，與對照組相比，PbA+VD組脾細胞培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平升高。同時，感染后第5天PbA+VD組小鼠血清中IL-10水平也顯著增加。
　　7、VD下調DCs數(shù)量
　　在小鼠感染

29、后第5天，對照組髓樣DCs(mDCs)和漿樣DCs(pDC)數(shù)量明顯高于PbA+VD組。在感染后第5天，PbA+VD組DCs共刺激分子MHCⅡ表達降低。此外，感染第5天，PbA+VD組DCs表面分子TLR4和胞內TLR9的表達也降低。
　　結論
　　我們的研究表明，VD在ECM發(fā)生過程中具有抗炎癥作用。更重要的是，我們的結果證實VD通過影響脾臟DCs數(shù)量，減少炎癥細胞因子IFN-γ，TNF以及趨化因子CXCL9，CXCL10