秸稈五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的菌株分離、選育及代謝研究.pdf

1、琥珀酸作為最重要四碳二元羧酸，被廣泛用于制備1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁酯、苯基化合物、生物材料聚合體PBS等化學(xué)品。到目前為止，琥珀酸的制備主要是采用基于石化資源的馬來(lái)酸酐法。隨著石化資源的日趨枯竭，研究利用生物質(zhì)發(fā)酵法制備琥珀酸倍受人們重視。在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用方面，發(fā)酵法制備燃料乙醇的研究是主要熱點(diǎn)之一，然而考慮到琥珀酸發(fā)酵具有固定二氧化碳的特征，其理論轉(zhuǎn)化率超過(guò)100％，所以，一旦技術(shù)難題得到解決，生物質(zhì)發(fā)酵制備琥珀酸比燃料乙醇

2、具有顯著的經(jīng)濟(jì)性優(yōu)勢(shì)。本文通過(guò)分離篩選得到一株基于秸稈五、六碳糖共發(fā)酵制備琥珀酸的菌株，并對(duì)其代謝及發(fā)酵做了重點(diǎn)研究，以望為建立一個(gè)基于秸稈生物質(zhì)轉(zhuǎn)化制備琥珀酸的綠色平臺(tái)提供技術(shù)支持。形成主要結(jié)論如下：
　　 (1)分離得到約300株細(xì)菌，這些菌株與常規(guī)的瘤胃菌具有基本相似的特征，多數(shù)為兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?，初步發(fā)酵顯示菌株S.JST具有良好的發(fā)酵潛力。通過(guò)基本的生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)菌株與放桿菌屬較接近，進(jìn)一步的API試驗(yàn)表明菌株與產(chǎn)琥

3、珀酸放線桿菌種較接近，于是進(jìn)行16S rRNA試驗(yàn)并提交到GenBank(EF044771.1)，本菌株的16S rRNA與Actinobacillus succinogenes1302菌株的16S rRNA同源性為99％，可確定本菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，命名為A.succinogenes S.JST。
　　 (2)通過(guò)中間體及抑制劑分析初步確定菌株能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖，以及琥珀酸來(lái)自草酰乙酸的兩步氫化所得。進(jìn)一步的酶活及相

4、關(guān)酶基因序列分析細(xì)化了細(xì)胞整體代謝的各個(gè)途徑與支路，在代謝途徑分析的基礎(chǔ)上，列出相關(guān)代謝方程，并進(jìn)一步給出代謝通量方程，即初步構(gòu)建菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)。利用構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)計(jì)算代謝通量，通量分析顯示琥珀酸途徑磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為琥珀酸，其流量最大，乙酸及乙醇作為主要的副產(chǎn)物占據(jù)了乙酰輔酶A的主要代謝支流，且節(jié)點(diǎn)分析表明該處節(jié)點(diǎn)為柔性節(jié)點(diǎn)，適于進(jìn)一步的改造。
　　 (3)在將氟乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉阴］o酶A并進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榉鷻幟?/p>

5、酸方面，磷乙酰轉(zhuǎn)移酶扮演著重要角色，而一旦形成氟檸檬酸則容易造成細(xì)胞的致死效應(yīng)，這最終導(dǎo)致了出發(fā)菌株不能夠在氟乙酸平板生長(zhǎng)，因此那些易于生長(zhǎng)的突變株可能就是在圍繞磷乙酰轉(zhuǎn)移酶的途徑發(fā)生了突變，基于此原理，本試驗(yàn)篩得一株突變株。對(duì)突變株及出發(fā)菌株分別做了PTA酶活及基因?qū)Ρ确治觯Y(jié)果表明PTA酶活降低了以及由此引起了乙酸的降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)乙酸與琥珀酸流量同時(shí)降低，乙酸流量的降低沒(méi)有引起琥珀酸的升高反促其降低，這看似難以解釋，然而進(jìn)一步的代謝

6、途徑分析發(fā)現(xiàn)，理論上在葡萄糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸的過(guò)程中生成的H還原力滿足不了琥珀酸合成所需，可這種矛盾卻能被乙酸的代謝所緩解，這是由于1摩爾乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸過(guò)程中凈增2摩爾NADH，這大大緩解了細(xì)胞內(nèi)H供體不足的矛盾，反之，突變株乙酸流量的降低則加劇了H供體不足的矛盾，因此應(yīng)對(duì)本突變株進(jìn)行其他方式的調(diào)控以及進(jìn)行乙醇降低選育。
　　 (4)通過(guò)定點(diǎn)篩得到一株乙醇代謝缺陷的復(fù)合突變株，由于在乙醇脫氫酶基因中間成功引入了“TAA”終止密

7、碼子，乙醇脫氫酶酶活顯著降低，流量分析顯示乙醇流量明顯降低以及琥珀酸流量得到了一定提升。由于細(xì)胞仍處于H還原力不足的狀態(tài)，琥珀酸上升的程度遠(yuǎn)低于乙醇降低的程度，對(duì)于復(fù)合突變株而言，由于H電子供體平衡沒(méi)有得到根本改善，其生產(chǎn)琥珀酸潛力沒(méi)有得到徹底挖掘，因此應(yīng)做進(jìn)一步的代謝調(diào)控。
　　 (5)通過(guò)氫氣、ORP以及E肝/HMP流量比的調(diào)控，圍繞H電子供體的代謝得到了很好地平衡，因此琥珀酸的流量最終得到了顯著的提升。同時(shí)，當(dāng)采用碳酸鎂代

8、替碳酸鈣作為發(fā)酵過(guò)程中和劑時(shí)，作為五碳糖木糖代謝關(guān)鍵酶的木酮糖激酶被進(jìn)一步激活，這最終促進(jìn)了五、六碳糖的共發(fā)酵。
　　 (6)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上的正交試驗(yàn)結(jié)果表明主要的離子及生物素濃度(mmol/L)采用如下條件時(shí)產(chǎn)酸較佳：鎂離子6.0、錳離子0.9、亞鐵離子0.6、鋅離子1.5、VB20.005、VB50.012、VB140.003及VB120.01。進(jìn)一步的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析表明，當(dāng)最佳條件為二氧化碳體積含量67％、氫氣4.8％及