芩丹膠囊及其有效成分槲皮素逆轉自發(fā)性高血壓大鼠心室肥厚的實驗研究.pdf

1、第一部分芩丹膠囊逆轉自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚的實驗研究
　　研究背景：
　　高血壓病是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病之一，心室肥厚是高血壓病常見的并發(fā)癥，是心臟猝死和其他心血管事件的一個獨立的危險因素，主要病理表現(xiàn)包括心肌細胞肥大、心肌間質細胞增生、細胞外基質的堆積，探討高血壓心室肥厚的發(fā)生機制對防治高血壓靶器官損害、降低死亡率具有重要意義。
　　過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferat

2、er-activated receptor-γ，PPAR-γ)是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員，近年來的研究證實，在逆轉高血壓心室肥厚的過程中起著關鍵的作用，在配體的激動下，PPARγ能抑制相關肥厚基因的表達，對高血壓心室肥厚引起的心力衰竭起著預防和治療的作用。NF-κB的激活在心肌肥厚的發(fā)展過程中至關重要，近年來研究表明NF-κB可能是抑制心肌肥厚的重要作用靶點。PPARγ可以直接與NF-κB發(fā)生蛋白質-蛋白質之間的相互作用，形成

3、轉錄抑制復合物，同時降低NF-κB與DNA結合活性，抑制NF-κBDNA合成，起到抑制其表達的作用。
　　芩丹膠囊(Qindan Capsule，QC)是導師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制成的治療高血壓病肝熱血瘀證的中藥復方制劑，前期研究表明其在改善高血壓血管重構中起著重要的作用，本研究通過研究芩丹膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌組織的病理學及超微結構的影響，應用免疫組織化

4、學法(immunohistochemistry)檢測PPAR-γ和NF-κB的蛋白表達的改變，以及熒光實時定量PCR(real-time PCR)檢測對下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達的影響，探討芩丹膠囊對改善SHR高血壓心室肥厚的作用機制，為芩丹膠囊治療高血壓心室肥厚的臨床應用提供有效的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察芩丹膠囊對SHR大鼠心肌形態(tài)學及超微結構的改變及對大鼠血壓的影響，探討芩丹膠囊抑制SHR大鼠心

5、肌肥厚的療效。
　　2.觀察芩丹膠囊在抑制SHR大鼠心肌肥厚對PPAR-γ和NF-κB的蛋白表達以及對下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達的影響，探討芩丹膠囊抑制SHR大鼠心肌肥厚的信號調控機制。
　　方法：
　　1.研究對象:8周齡雄性SHR大鼠32只和8周齡Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。隨機分為5組，每組8只:
　　(1)WKY對照組;
　　(2)SHR對照組;
　　(3)SHR

6、+替米沙坦組(SHR+Tel);
　　(4)SHR+芩丹膠囊大劑量組(SHR+QCH);
　　(5)SHR+芩丹膠囊小劑量組(SHR+QCL)。
　　SHR+Tel組給予Tel10mg/(kg·d)，SHR+QCH組給予芩丹膠囊750mg/(kg-d)，SHR+QCL組給予芩丹膠囊150mg/（kg·d），WKY對照組和SHR對照組分別給予等量蒸餾水。各組大鼠均分別灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12周。末次給藥后禁食24

7、h，不禁水。3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射，麻醉后進行后續(xù)實驗。
　　2.研究內(nèi)容:
　　(1)每兩周測量尾動脈收縮壓(SBP)，每周稱取體質量(BW)一次;
　　(2)處死動物后，稱取左心室質量(LVM)，并計算左室相對質量指數(shù)(LVM/BW);
　　(3)HE染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài);
　　(4)電鏡觀察各組大鼠心肌組織超微結構;
　　(5)免疫組織化學測定心肌組織中PPAR-γ和N

8、F-κB蛋白的表達;
　　(6)實時定量RT-PCR法檢測心肌組織中肥厚基因ANP、BNP的mRNA的表達。
　　3.統(tǒng)計學處理計量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標準誤表示，統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的相關統(tǒng)計分析。兩個組之間的數(shù)據(jù)比較用獨立樣本的t檢驗，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗。當P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.各組大鼠

9、治療前后收縮壓的動態(tài)變化
　　與8周齡WKY陰性對照組大鼠比較，8周齡SHR陽性對照組大鼠血壓已經(jīng)明顯升高(P＜0.05)。在實驗過程中，陽性對照組SHR大鼠收縮壓呈持續(xù)升高狀態(tài)，與20周齡陰性對照組的WKY組相比，20周齡陽性對照SHR組大鼠收縮壓顯著增加(P＜0.05)。從給藥第4周起，SHR+QCH組、SHR+QCL組、SHR+Tel組大鼠的血壓與SHR對照組相比均有下降，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但各組下降程度

10、不同;給藥7周到12周期間，SHR+QCH組較SHR+QCL組血壓下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。20周齡SHR+Tel組大鼠收縮壓與同周齡SHR+QCH組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.左室相對質量(LVM/BW)
　　與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠與對照組WKY大鼠相比LVM/BW明顯升高(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QCH組，SHR+Q

11、CL組和SHR+Tel組大鼠LVM/BW顯著減小(P＜0.05)。兩兩比較分析，SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)。
　　3.各組大鼠心肌組織切片光鏡下HE染色觀察
　　20周齡WKY組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色分布均勻。SHR組大鼠可見心肌細胞排列紊亂，細胞核大小不規(guī)則，胞漿染色加深，細胞內(nèi)心肌纖維斷裂，單位面積內(nèi)細胞核數(shù)量增多的表現(xiàn)。與SHR組大鼠比較，SHR+Tel組和SH

12、R+QCH組、SHR+QCL組大鼠見心肌細胞排列較為整齊，細胞核偶見大小不規(guī)則，細胞內(nèi)心肌纖維斷裂情況明顯好轉，單位面積細胞核數(shù)目略增多。
　　4.各組大鼠心肌組織超微結構的觀察
　　電鏡下，WKY心肌纖維排列清晰、整齊，心肌細胞質膜連續(xù)、完整，線粒體結構、閏盤結構正常;粗細肌絲排列整齊，肌小節(jié)及明暗各帶清晰可見，Z線較清晰，間質纖維無增生，細胞核染色質分布較均勻;SHR組大鼠心肌纖維排列稀疏、紊亂，線粒體腫脹、破壞甚至呈空

13、泡狀，Z線增寬模糊，可見細胞核染色質邊聚的現(xiàn)象;伴有肌原纖維呈灶性溶解，出現(xiàn)肌節(jié)對位不齊，肌絲扭曲、斷裂，間質可見大量膠原纖維分布。SHR+Tel組，SHR+QCH組，SHR+QCL組較SHR組好轉，大部分肌纖維排列緊密，線粒體結構相對完整，且排列適當，細胞核無明顯邊聚現(xiàn)象，間質內(nèi)膠原堆積已不明顯。
　　5.心肌組織免疫組織化學PPARγ、NF-κB蛋白表達水平比較
　　(1)與20周齡陰性對照組WKY組相比，陽性對照SHR

14、組大鼠PPARγ蛋白的表達較WKY組明顯減少(P＜0.05);SHR+Tel組，SHR+QCH組，SHR+QCL組較SHR組PPARγ核表達明顯增多(P＜0.05)，有顯著性差異;SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(2)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組NF-κB蛋白與WKY組比較，核表達明顯增多(P＜0.05)，SHR+QCH

15、組、SHR+QCL組和SHR+Tel組表達較SHR組均減少(P＜0.05)，SHR+QCH組與SHR+QCL組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.實時定量RT-PCR法檢測心肌組織中肥厚基因的ANP，BNPmRNA的表達水平的比較
　　(1)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組大鼠ANPmRNA與WKY組比較表達明顯增多(P＜0.05)，SHR

16、+QCH組、SHR+QCL組和SHR+Tel組ANPmRNA表達較SHR組均減少(P＜0.05);SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(2)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組大鼠BNPmRNA與WKY組比較表達明顯增多(P＜0.05)，SHR+QCH組、SHR+QCL組和SHR+Tel組BNPmRNA表達較SHR組均減少(P＜0.

17、05);SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論：
　　(1)芩丹膠囊對SHR大鼠心室肥厚有明顯的逆轉作用，其具體表現(xiàn)為:改善SHR大鼠心肌形態(tài)學指標，降低心肌細胞的體積，改善心肌的超微結構。
　　(2)芩丹膠囊具有PPARγ部分激動劑的作用，改善心肌肥厚可能是通過部分激活PPAR-γ抑制NF-κB的表達，進而調節(jié)其下游肥厚基因AN

18、P，BNP的mRNA的表達。
　　第二部分槲皮素激活PPAR-γ對自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚AP-1信號轉導通路的影響
　　研究背景：
　　高血壓病是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病之一，其并發(fā)癥心肌肥厚在世界范圍內(nèi)是導致心力衰竭和心臟猝死的一個獨立的危險因素;心肌肥厚反應主要的特征包括心肌細胞的肥大，收縮蛋白含量的增加，以及胚胎基因如心房利鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)的再表達。在各種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，心肌肥

19、厚早期是對各種心臟疾病血壓升高的一種適應性反應，是一種慢性代償機制;但是持續(xù)的細胞外信號刺激會導致心肌重塑而最終導致心力衰竭的發(fā)生。
　　過氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPAR-γ）是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員，在逆轉高血壓心室肥厚的過程中起著關鍵的作用，在相關配體的激動下，PPAR-γ能抑制心肌肥厚基因的表達，對高血壓心室肥厚引起的

20、心力衰竭起著預防和治療的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AP-1(activator protein-1)的激活在心肌肥厚的發(fā)展過程中的作用引起了廣泛的關注，AP-1家族成員中以C-Jun及C-Fos為主，且以C-Jun/C-Fos異二聚體形式的AP-1生物學活性最強，可參與調節(jié)各種細胞增殖，分化，轉化反應的過程。在心血管的疾病中，AP-1是心肌肥厚中重要的轉錄因子，它調控的心肌肥厚反應基因包括心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)等心肌早期應答基因

21、。實驗研究表明，過量表達c-Jun的顯形負突變(dominant negative mutation)可以抑制ET-1和PE誘導的涉及AP-1的活性、蛋白合成、肌細胞生長、ANP、BNP基因的表達等一系列心肌肥厚的變化，這些方面都說明AP-1在調控心肌肥厚中起到了重要的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ可通過DNA依賴的方式抑制激活蛋白-1(AP-1)介導的信號通路。
　　槲皮素(3，3'，4'，5，7-pentahydroxyfl

22、avone，Que)，是生物黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，在調節(jié)心血管系統(tǒng)功能方面有良好的發(fā)展前景。槲皮素是芩丹膠囊中桑寄生的有效成分，具有良好的降壓作用，同時還具有抗氧化、抗血栓、抗炎、減輕心肌肥厚等多種心血管保護作用。近期研究表明，黃酮類可以通過激活了過氧化物酶體增殖物γ抑制在大鼠巨噬細胞誘導的環(huán)氧酶和一氧化氮合酶的活動。本研究通過研究槲皮素對SHR大鼠心肌組織的病理學及超微結構的觀察，以及應用熒光實時定量PCR(real-ti

23、me PCR)和免疫組織化學法(immunohistochemistry)檢測PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白及mRNA表達的改變，以及對下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達的影響，探討槲皮素對改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心室肥厚的作用機制，為槲皮素治療高血壓心室肥厚的臨床應用提供有效的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察槲皮素對SHR

24、大鼠心肌形態(tài)學及超微結構的改變，及對大鼠血壓和心動超聲的影響，探討槲皮素抑制SHR大鼠心肌肥厚的療效。
　　2.探討槲皮素在抑制SHR大鼠心肌肥厚對PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)的蛋白的表達以及下游基因ANP、BNP的mRNA表達的影響，探討槲皮素抑制SHR大鼠心肌肥厚的信號調控機制。
　　方法：
　　1.研究對象:8周齡雄性SHR大鼠24只和8周齡Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。隨機分為

25、4組，每組8只:
　　(1)WKY對照組;
　　(2)SHR對照組;
　　(3)SHR+槲皮素高劑量組（SHR+QH;10mg.kg-1，溶于1ml的二甲基纖維素）;
　　(4)SHR+槲皮素低劑量組（SHR+QH;5mg.kg-1，溶于1ml的二甲基纖維素），WKY對照組和SHR對照組分別給予等量蒸餾水。
　　各組大鼠均灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12周。末次給藥后禁食24h，不禁水。3％戊巴比妥鈉(30

26、mg/kg)腹腔注射麻醉后，進行后續(xù)相關實驗。
　　2.研究內(nèi)容:
　　(1)每兩周測量尾動脈收縮壓(SBP)，每周稱取體質量(BW)一次;
　　(2)實驗開始和結束時行常規(guī)超聲心動圖檢查;
　　(3)處死動物后，稱取左心室質量(LVM)，并計算左室相對質量指數(shù)(LVM/BW);
　　(4)HE染色和Masson染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)并測量大鼠心肌纖維直徑和進行心肌組織間質膠原定量;
　　(5)電鏡

27、觀察大鼠心肌組織超微結構;
　　(6)免疫組織化學測定心肌組織中PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白的表達及定位;
　　(7)實時定量RT-PCR法檢測心肌組織中PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)，ANP、BNP的mRNA的表達;
　　(8)Western-blot檢測大鼠心肌組織PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)的表達。
　　3.統(tǒng)計學處理計量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標準誤

28、表示，統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的相關統(tǒng)計分析。兩個組之間的數(shù)據(jù)比較用獨立樣本的t檢驗，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗。當P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.各組大鼠治療前后收縮壓的動態(tài)變化
　　與8周齡正常血壓對照組WKY大鼠比較，8周齡SHR各組大鼠血壓已經(jīng)明顯升高(P＜0.05)。實驗過程中，SHR組大鼠收縮壓可呈持續(xù)升

29、高狀態(tài);與20周齡正常血壓的WKY組相比，20周齡SHR組大鼠收縮壓顯著增加(P＜0.05)。給藥第4周起，SHR+QH組、SHR+QL組大鼠的血壓與模型組SHR組相比均有下降，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給藥7周到12周期間，槲皮素大劑量組較低劑量組血壓下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.左室相對質量(LVM/BW)
　　與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠LVM/

30、BW明顯增加(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QH組和SHR+QL組大鼠LVM/BW顯著減?。≒＜0.05）。兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著(P＜0.05)。
　　3.超聲心動圖檢測
　　與8周齡的WKY組比較，8周齡的SHR各組大鼠心室肥厚指標IVSd，LVPWd均明顯增加(P＜0.05);與20周齡的SHR組相比較，20周齡SHR+QH組、SHR+QL組心室肥厚指標IVSd，LVP

31、Wd等均降低(P＜0.05);20周齡SHR+QH組、SHR+QL組的LVIDd，MFS，E/A等指標均明顯升高(P＜0.05)，提示心臟功能得到改善。
　　4.各組大鼠心肌組織切片光鏡下HE染色觀察
　　20周齡WKY組大鼠心肌細胞排列整齊，胞漿染色均勻，細胞核大小均一。SHR組大鼠則見心肌細胞排列紊亂，胞漿染色加深，且細胞核大小不規(guī)則，細胞內(nèi)可見心肌纖維斷裂的現(xiàn)象。與20周齡SHR組大鼠相比，SHR+QH組和SHR+QL

32、組大鼠心肌細胞排列較為整齊，細胞內(nèi)心肌纖維斷裂情況已明顯好轉，細胞核偶見大小不規(guī)則。
　　5.大鼠心肌纖維直徑(MFD)的比較
　　與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠心肌纖維直徑明顯增加(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QH組和SHR+QL組大鼠心肌纖維直徑顯著減小(P＜0.05)。兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著（P＜0.05）。
　　6.各組大鼠心肌組

33、織超微結構的觀察
　　電鏡下，20周齡WKY組表現(xiàn)為心肌細胞核仁清晰，線粒體、閏盤、Z線清楚完整，心肌纖維排列清晰、整齊，間質纖維無增生，細胞核染色質分布較均勻，無膠原分泌。20周齡SHR組表現(xiàn)為線粒體嚴重腫脹，嵴消失斷裂，肌絲排列紊亂，閏盤及Z線不清，內(nèi)質網(wǎng)擴大，大量的膠原纖維增生成點片狀，部分心肌細胞核可見染色質邊集的早期凋亡形態(tài)改變。SHR+QL組表現(xiàn)為心肌肌原纖維規(guī)則排列，閏盤整齊，細胞間質水腫不明顯，肌漿網(wǎng)輕度擴張，肌原

34、纖維整齊排列，有輕度線粒體腫脹，無明顯壞死。SHR+QH組表現(xiàn)為偶有點狀膠原纖維增生，肌絲排列相對整齊，較SHR組有明顯改善，膠原增生受到明顯抑制。
　　7.心肌組織切片光鏡下Masson染色觀察
　　光鏡下Masson染色顯示心肌細胞染色呈紅色，間質膠原呈藍綠色。WKY組大鼠膠原組織分布較稀疏，相鄰細胞的膠原纖維網(wǎng)著色淡完好;SHR組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，圍繞心肌細胞的膠原纖維網(wǎng)排列紊亂、斷裂;與SHR組大鼠相比，SHR

35、+QH組和SHR+QL組膠原纖維明顯減少，膠原含量明顯下降，排列較規(guī)整，且呈一定的劑量依賴性。
　　8.大鼠心肌膠原面積百分比(VFC)比較
　　與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠心肌膠原面積百分比明顯增加(P＜0.05)。與SHR組相比，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組大鼠心肌膠原面積百分比顯著減少(P＜0.05)，兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著(P＜0.05)。

36、r>　　9.心肌組織免疫組織化學PPAR-γ、AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白表達水平比較
　　1)與20周齡正常WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的核表達較WKY組明顯減少(P＜0.05);SHR+QH組、SHR+QL組較SHR組PPAR-γ核表達明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組與WK

37、Y組比較，AP-1(C-Jun，C-Fos)核表達明顯增多(P＜0.05)，SHR+QH組、SHR+QL組表達較SHR組均減少(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　10.實時定量RT-PCR法檢測心肌組織中肥厚基因的ANP，BNPmRNA的表達水平的比較
　　1)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的mRNA表達量較WKY組明顯減少(P

38、＜0.05);與20周齡的SHR大鼠相比較，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組較SHR組PPAR-γmRNA表達明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常WKY大鼠相比，SHR大鼠AP-1(C-Jun，C-Fos)，ANP，BNP的mRNA表達明顯增多(P＜0.05)，經(jīng)槲皮素治療12周后，SHR+QH組、SHR+QL組AP-1(C-

39、Jun，C-Fos)，ANP，BNP的mRNA表達較SHR組均明顯減少(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　11.Western blot檢測分析PPAR-γ、AP-1(c-fos，c-jun)蛋白表達水平比較
　　1)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的蛋白表達量較WKY組明顯減少(P＜0.05);與20周齡的SHR大鼠相比較

40、，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組較SHR組PPAR-γ蛋白表達量明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常血壓對照組WKY大鼠相比，SHR組AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白表達量明顯增多(P＜0.01)，與20周齡的SHR大鼠相比較，20周齡SHR+QH組、SHR+QL組蛋白表達量較SHR組均減少(P＜0.05);兩兩比較分析，S

41、HR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　(1)槲皮素對SHR大鼠心室肥厚有明顯的逆轉作用，其具體表現(xiàn)為:改善SHR大鼠心肌形態(tài)學指標，降低心肌組織膠原含量，改善心肌的超微結構和心功能的指標。
　　(2)槲皮素具有PPAR-γ部分激動劑的作用，在改善心肌肥厚的機制部分可能是激活PPAR-γ抑制肥厚轉錄因子AP-1(C-Jun，C-Fos)的表達，進而調節(jié)其下游ANP、BNP的mR

42、NA的肥厚基因的表達。
　　第三部分槲皮素對血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞肥厚PPAR-γ/AP-1信號轉導通路的影響
　　研究背景：
　　心肌肥大是心肌細胞對多種病理刺激如壓力過負荷、神經(jīng)體液因子以及心肌收縮蛋白基因突變等出現(xiàn)的一系列組織細胞形態(tài)學的適應性反應，肥大特征表現(xiàn)主要包括心肌細胞體積增大，蛋白質合成增加和胚胎期的表達基因再表達。一方面它是心臟早期的適應性反應，是一種慢性代償機制，許多神經(jīng)體液因子和心肌的

43、旁分泌因子參與到心肌肥厚的適應性反應中。另一方面它又是晚期心臟猝死和其他心血管事件的一個獨立的危險因素。因此，逆轉高血壓心肌肥厚是防治高血壓及其靶器官損害的關鍵所在。
　　許多研究證實，心臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而AngⅡ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是起主要作用的生物活性物質。體內(nèi)和體外實驗都顯示AngⅡ是致心肌細胞肥大的重要因子，血管緊張素Ⅱ可以直接促進心臟和血管細胞生

44、長，部分通過各種生長因子和細胞外基質蛋白以及細胞因子的誘導。研究發(fā)現(xiàn)包括核轉錄因子AP-1在內(nèi)很多信號分子在AngⅡ引發(fā)的心肌肥大反應中發(fā)揮重要作用，這些轉錄因子反過來又能調節(jié)細胞的生長和細胞外基質的生物合成。大量研究表明，參與構成轉錄激活因子AP-1家族成員中以C-Jun及C-Fos為主，且以C-Jun/C-Fos異二聚體形式的AP-1生物學活性最強，并且直接抑制AP-1的活性可以直接降低心肌肥厚的發(fā)生。因此，當原癌基因如c-fos和

45、c-jun作為初始應答基因時，所編碼的產(chǎn)物Fos和Jun作為核內(nèi)轉錄調控時因子和第三信使，通過一個亮氨酸拉鏈形成異源二聚體，與位于5'端上游調控區(qū)的AP-1位點（TGACTGA保守序列）結合，進一步促進次級應答基因如心房利尿鈉因子(ANF)、腦鈉肽(BNP)轉錄和蛋白質合成，導致心肌細胞蛋白質合成增加，蛋白表型向胚胎型轉化等心肌肥厚的特征性變化。因此，對心肌肥大信號轉導通路的深入認識，不僅有助于闡明心肌肥厚的細胞分子機制，而且為心肌肥厚

46、的防治提供新的策略。
　　槲皮素（3，3'，4'，5，7-pentahydroxyflavone，Que），是自然界中分布最廣的生物黃酮類化合物。槲皮素是芩丹膠囊中桑寄生的有效成分，我們前期的實驗表明槲皮素能夠通過TGF-β1/Smad2信號通路改善TGF-β1誘導的成纖維細胞的增殖。同時，我們的體內(nèi)動物實驗表明槲皮素能有效的抑制SHR大鼠心肌肥厚的發(fā)生，但是它對心臟的保護作用的靶點和細胞內(nèi)的信號轉導機制還沒有完全的闡述清楚。因此

47、，本研究擬進一步探明槲皮素在抑制心肌肥厚的過程中的相關信號通路。我們通過檢測槲皮素對AngⅡ誘導的H9C2心肌細胞肥厚的影響，應用免疫熒光檢測PPAR-γ，AP-1(C-Fos，C-Jun)蛋白的表達。同時，采用siRNA阻斷PPAR-γ蛋白的表達，應用熒光實時定量RT-PCR檢測ANP，BNPmRNA表達情況以及western blot檢測C-Fos，C-Jun蛋白表達的改變，探討槲皮素抑制AngⅡ誘導的H9C2心肌肥厚的生物活性的途

48、徑，為其臨床防治高血壓性心肌肥厚提供科學依據(jù)。
　　目的：
　　1.本研究通過建立血管緊張素Ⅱ誘發(fā)的大鼠H9C2心肌細胞肥厚模型，考察槲皮素對心肌細胞表面積、[3H]-亮氨酸的摻入測定的影響。
　　2.通過siRNA阻斷心肌細胞的PPAR-γ途徑，考察槲皮素對轉錄因子C-Fos，C-Jun的蛋白表達及心肌肥厚特異性指標ANP和BNPmRNA表達的影響，探討槲皮素抑制心肌肥厚的作用機制。
　　方法：
　　1.

49、常規(guī)復蘇、培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9C2至對數(shù)生長期備用，構建血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞H9C2肥大模型，加入不同濃度的槲皮素，孵育一定時間。
　　2.采用相差顯微鏡觀察細胞大小，軟件分析測量心肌細胞表面積，[3H]-亮氨酸摻入法測定心肌細胞蛋白質合成速率。
　　3.細胞免疫熒光法測定PPAR-γ、C-Fos及C-Jun的蛋白水平及其細胞內(nèi)的定位。
　　4.根據(jù)GenebanK中PPAR-γ的序列號，設計并化學合成PPAR-

50、γsiRNA和沒有明顯同源性的非特異性陰性對照NCsiRNA。
　　5.常規(guī)培養(yǎng)H9C2細胞至對數(shù)生長期，種于六孔板中，將實驗分為實驗組（轉染PPAR-γ特異性siRNA），陰性對照組（轉染PPAR-γ陰性對照siRNA），空白對照組（不轉染任何siRNA，余試劑與其他兩組相同），進行轉染。
　　6.采用Western-blot技術分別檢測三組細胞轉染后PPAR-γ蛋白的表達水平，以檢測siRNA對PPAR-γ的阻斷效率。<

51、br>　　7.細胞轉染后，槲皮素與AngⅡ細胞共培養(yǎng)，Western-blot法檢測C-Fos，C-Jun的蛋白表達水平，RT-PCR法檢測心肌肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達水平。
　　8.統(tǒng)計學處理:計量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標準誤表示，統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的相關統(tǒng)計分析。兩個組之間的數(shù)據(jù)比較用獨立樣本的t檢驗，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗。當

52、P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.各實驗組細胞的[3H]-亮氨酸摻入量測定
　　AngⅡ刺激H9C2細胞建立心肌細胞肥厚模型后，AngⅡ組的[3H]-亮氨酸摻入量與正常對照組相比較明顯升高（P＜0.01），但是在與槲皮素共培養(yǎng)后，[3H]-亮氨酸摻入量明顯降低(P＜0.01)，且其抑制蛋白合成速率作用呈劑量依賴性。
　　2.H9C2細胞表面積的測定
　　AngⅡ刺激H9C2細胞建立心肌細

53、胞肥厚模型后，AngⅡ組的H9C2細胞表面積與正常對照組相比較明顯升高(P＜0.01)，但是與槲皮素共培養(yǎng)后，AngⅡ+Que組H9C2細胞表面積明顯降低（P＜0.01）。
　　3.細胞免疫熒光檢測
　　(1)與正常對照組相比，AngⅡ組H9C2心肌細胞免疫熒光法測定PPAR-γ的核表達較正常對照組明顯減少(P＜0.01);AngⅡ+Que組H9C2心肌細胞免疫熒光較AngⅡ組PPAR-γ核表達明顯增多，有統(tǒng)計學意義（P＜0

54、.01）;
　　(2)與正常對照組相比，AngⅡ組H9C2心肌細胞免疫熒光法測定C-Fos，C-Jun的核表達較正常對照組明顯增多(P＜0.01);AngⅡ+Que組H9C2心肌細胞細胞免疫熒光較AngⅡ組的C-Fos，C-Jun核表達明顯減少，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　4.Western blot檢測分析
　　(1)siRNA轉染24h后，與空白對照組相比，實驗組PPAR-γsiRNA組的PPAR-γ蛋白表

55、達水平明顯下調(P＜0.01)，與正常細胞組相比，陰性對照組NCPPAR-γsiRNA的表達與空白對照組則無統(tǒng)計學差異(P＞0.01)。
　　(2)siRNA轉染48h后，給予刺激AngⅡ和槲皮素的共培養(yǎng)后，與AngⅡ組相比較，PPAR-γsiRNA組的C-Fos，C-Jun無明顯下降(P＞0.01)，陰性對照組NCPPAR-γsiRNA與AngⅡ組比較則明顯下降(P＜0.01)。
　　5.RT-PCR檢測
　　(1)

56、siRNA轉染24h后，與AngⅡ組相比，實驗組PPAR-γsiRNA組的ANPmRNA表達水平無明顯差異(P＞0.01)，陰性對照組NCPPAR-γsiRNA的ANPmRNA表達與AngⅡ組比較則明顯下降(P＜0.01)。
　　(2)siRNA轉染24h后，與AngⅡ組相比，實驗組PPAR-γsiRNA組的BNPmRNA表達水平無明顯差異（P＞0.01），陰性對照組NCPPAR-γsiRNA的BNPmRNA表達與AngⅡ組比較則