Wnt與Notch信號通路調(diào)控造血發(fā)育機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究在造血發(fā)育過程中不同階段不同部位，c-kit+造血祖細(xì)胞中Wnt和Notch信號通路中各成分的時(shí)空表達(dá)變化。
　　 方法：用免疫磁珠陽性分離法分離小鼠孕10.5天(E10.5)、E11.5 AGM區(qū)，E12.5、E14.5、E16.5、E18胎肝(Fetal liver，F(xiàn)L)和成體骨髓(Bone marrow，BM)來源的c-kit陽性造血祖細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其分選純度。實(shí)時(shí)定量PCR檢測以上時(shí)間點(diǎn)和部位分選的造血

2、祖細(xì)胞中Wnt信號通路成員(wnt3a，wnt5a，wnt10b，F(xiàn)rizzled3，F(xiàn)rizzled4，F(xiàn)rizzled7，c-myc，ccnb1)和Notch信號通路成員（notch1，notch2，notch3，notch4，jagged1，hes1）的基因表達(dá)變化，免疫熒光染色法分別鑒定E10.5 AGM區(qū)，E14.5 FL以及BM來源的c-kit+細(xì)胞中WNT3a和NOTCH1蛋白的表達(dá)。將E10.5 AGM區(qū)，E14.5 F

3、L以及BM來源的c-kit+細(xì)胞體外培養(yǎng)7天，檢測其增殖、分化以及集落形成能力。
　　 結(jié)果：免疫磁珠陽性選擇法分選的c-kit+細(xì)胞，純度可達(dá)90％以上。Wnt和Notch信號通路基因在各發(fā)育階段的c-kit+造血祖細(xì)胞均有表達(dá)。其中，Wnt和Notch信號通路成員基因在AGM區(qū)來源的c-kit+造血祖細(xì)胞中均高表達(dá)；胎肝來源c-kit+造血祖細(xì)胞中Notch通路基因表達(dá)水平較低，明顯低于AGM區(qū)和骨髓來源c-kit+造血祖細(xì)

4、胞的表達(dá)；而骨髓來源的c-kit+造血祖細(xì)胞中Wnt通路基因表達(dá)水平較低，明顯低于AGM區(qū)和FL來源c-kit+造血祖細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示，在AGM區(qū)，F(xiàn)L和BM來源的c-kit+細(xì)胞中，WNT3a和NOTCH1蛋白均有不同程度的表達(dá)。E10.5 AGM區(qū)內(nèi)WNT3a和NOTCH1蛋白表達(dá)最高。與AGM區(qū)以及骨髓相比，F(xiàn)L來源的c-kit+細(xì)胞NOTCH1蛋白的表達(dá)較低。與胎肝相比，骨髓來源的細(xì)胞WNT3a的表達(dá)

5、明顯降低而NOTCH1蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。體外培養(yǎng)7天后，AGM區(qū)和胎肝來源細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，胎肝來源細(xì)胞易于分化，而骨髓來源細(xì)胞易于維持其未分化狀態(tài)。在體外集落形成能力方面，AGM 區(qū)來源 c-kit+細(xì)胞具有較強(qiáng)的形成混合集落形成單位(CFU-Mix)的能力；而FL、BM 來源c-kit+細(xì)胞則能形成更多粒單系集落形成單位(CFU-GM)。
　　 結(jié)論：造血發(fā)育過程中，不同發(fā)育階段的造血祖細(xì)胞的Wnt和