結(jié)締組織生長(zhǎng)因子及其受體整合素ανβ3在增生性瘢痕發(fā)病機(jī)理中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】
　　增生性瘢痕是人類皮膚真皮受損后,局部以大量膠原沉積為特征的皮膚纖維化疾病。大量研究表明,作為瘢痕中的最主要細(xì)胞成纖維細(xì)胞,其活化、增殖、合成分泌膠原以及分化異常,是增生性瘢痕發(fā)生及發(fā)展的重要原因之一。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor,CTGF,又稱為CCN2)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的共作用因

2、子在調(diào)控成纖維細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用,被認(rèn)為是一種強(qiáng)烈的致纖維化因子。整合素ανβ3是CCN2的主要受體之一,研究表明其在傳遞和細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、分布、定居、生存或凋亡等有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)方面發(fā)揮重要作用;MAPK信號(hào)通路是真核細(xì)胞調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng),它可以被外界各種刺激所激活,而且已有報(bào)道提示它可能參與了 CCN2調(diào)控纖維化發(fā)生的過程,但其作用在各個(gè)臟器中的報(bào)道并不一致,存在組織器官特異性,其具體的分子機(jī)制尚不清楚。因

3、此本課題主要對(duì) CCN2在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性研究,通過觀察其受體整合素ανβ3及下游MAPK信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用,明確CCN2在增生性瘢痕形成及發(fā)展中的具體作用機(jī)制,希望能為闡明增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)理提供新思路。
　　【研究目的】
　　1.明確CCN2的受體整合素ανβ3在增生性瘢痕組織、瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　2.明確MAPK信號(hào)通路在CCN2調(diào)控增生性瘢痕中的具體

4、作用,初步探討其作用機(jī)制,并在兔耳瘢痕模型中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　【研究?jī)?nèi)容】
　　1.檢測(cè)CCN2的受體整合素ανβ3在增生性瘢痕組織、瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　2.檢測(cè)在CCN2誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中,其相應(yīng)標(biāo)志性分子的表達(dá)變化情況,整合素αν、整合素β3受體分子的表達(dá)變化;應(yīng)用整合素ανβ3的特異性阻斷劑LM609,觀察其在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中作用,并用三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增生性瘢痕成

5、纖維細(xì)胞收縮功能的改變。
　　3.使用CCN2刺激增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后,采用免疫印跡的方法,觀察MAPK信號(hào)通路的激活情況;通過應(yīng)用該信號(hào)通路的特異性阻斷劑,檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志分子表達(dá)特性的變化;用CCN2或與TGF-β1聯(lián)合刺激正常真皮成纖維細(xì)胞,觀察其α-SMA、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ表達(dá)的變化;采用免疫印跡、免疫組織化學(xué)的方法,觀察磷酸化ERK及JNK在增生性瘢痕中的表達(dá)情況;構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型,觀察CCN2與

6、MAPK阻斷劑的作用。
　　【研究結(jié)果】
　　1.通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn),增生性瘢痕組織中整合素αv、整合素β3受體的表達(dá)水平顯著上調(diào);而且,在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中,整合素αv、整合素β3受體的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。
　　2. CCN2作用增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后,α-SMA、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá)均明顯升高,整合素αv、整合素β3受體的表達(dá)水平也顯著上調(diào);應(yīng)用整合素ανβ3的特異性阻斷劑LM609,可以明顯抑制CCN2誘導(dǎo)增生性瘢

7、痕成纖維細(xì)胞后α-SMA、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá);三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)顯示,LM609可以顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的收縮功能。
　　3.使用CCN2刺激增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后,可誘導(dǎo)細(xì)胞中ERK1/2、p38、JNK信號(hào)通路的磷酸化,其中ERK1/2、JNK信號(hào)通路的磷酸化至15 min時(shí)達(dá)到高峰,p38信號(hào)通路的磷酸化至30 min達(dá)到高峰,通過應(yīng)用其特異性阻斷劑PD98059、SB203580、SP600125,可以顯著抑制CC

8、N2所誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路的磷酸化。
　　4.應(yīng)用PD98059后,可明顯抑制CCN2所導(dǎo)致的膠原ⅠmRNA的表達(dá)。然而,應(yīng)用SB203580和SP600125后,對(duì)CCN2所導(dǎo)致的膠原ⅠmRNA的表達(dá)未見明顯抑制作用;Western-blot結(jié)果顯示,在應(yīng)用這3個(gè)阻斷劑后,CCN2所誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原表達(dá)被抑制,并且PD98059的抑制效果最強(qiáng)。在對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌膠原的水平進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn), PD98059和SP600125

9、可明顯降低CCN2所導(dǎo)致的Ⅰ型膠原分泌,而SB203580對(duì)CCN2所導(dǎo)致的Ⅰ型膠原分泌未見明顯的抑制作用。
　　5. Western-blot結(jié)果顯示,CCN2作用增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后48 h,α-SMA的表達(dá)明顯升高,在應(yīng)用SB203580,SP600125或PD98059預(yù)處理后,α-SMA表達(dá)的升高可被明顯抑制,且PD98059組的作用最為明顯。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,CCN2作用48 h后,增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SM

10、A的表達(dá)明顯升高,而 SP600125或PD98059預(yù)處理后,α-SMA的表達(dá)顯著下調(diào),且PD98059組的作用最為明顯,但應(yīng)用SB203580預(yù)處理后,α-SMA的表達(dá)升高未被明顯抑制。
　　6.應(yīng)用TGF-β1+CCN2聯(lián)合處理后,可以使正常成纖維細(xì)胞中α-SMA、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá)明顯升高,CCN2單獨(dú)處理時(shí)未見明顯變化,而且在應(yīng)用TGF-β1Ⅰ型受體的特異性阻斷劑SB431542預(yù)處理后,可顯著降低TGF-β1與CCN

11、2聯(lián)合作用所導(dǎo)致α-SMA、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ表達(dá)的升高,而且Western-blot的結(jié)果顯示,單獨(dú)應(yīng)用SB431542預(yù)處理后,與對(duì)照組相比可以抑制正常成纖維細(xì)胞中膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá)。
　　7.采用Western-blot及免疫組織化學(xué)的方法,我們發(fā)現(xiàn)與正常皮膚組織相比,增生性瘢痕組織中磷酸化ERK和JNK的表達(dá)均明顯升高。
　　8.在體內(nèi)試驗(yàn)中,我們成功構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比, SP600125或PD9

12、8059處理組,兔耳瘢痕質(zhì)地較柔軟平整,可明顯抑制兔耳瘢痕的增生,而且單獨(dú)應(yīng)用CCN2并不能加重瘢痕的增生程度;膠原染色發(fā)現(xiàn),對(duì)照組、PBS處理組、CCN2處理組膠原纖維致密粗大,真皮層較厚,膠原纖維排列紊亂;CCN2+SP600125組、CCN2+PD98059組、PD98059組及SP600125組,真皮層亦增厚,但較對(duì)照組、PBS組、CCN2組薄,膠原纖維排列較整齊,膠原纖維較稀疏。
　　【研究結(jié)論】
　　1.與自體正

13、常皮膚及正常真皮成纖維細(xì)胞相比,增生性瘢痕組織及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中整合素αv、整合素β3受體的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。
　　2. CCN2作用增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)分化,并且在這個(gè)過程中CCN2的受體整合素ανβ3發(fā)揮重要作用。
　　3. CCN2可以明顯激活MAPK信號(hào)通路,外源性的抑制ERK1/2、JNK信號(hào)通路,可顯著抑制CCN2所誘導(dǎo)的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)。
　　4.在體內(nèi)試驗(yàn)中,我