AMHRⅡ、INSR基因DNA甲基化與PCOS表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是指女性青春期發(fā)病，以月經(jīng)紊亂、持續(xù)排卵障礙和卵巢多囊樣改變，合并高雄激素血癥（Hyperandrogenism，HA）和高胰島素血癥(Hyperinsulinemia，HI)為主要臨床特征的生殖功能障礙與代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合癥。PCOS臨床表現(xiàn)多樣化，表現(xiàn)為高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象。目前有關(guān)PCOS病因和發(fā)病機理研究有諸多報道，但其病因和確切發(fā)病機制

2、仍不清楚。尤其是PCOS發(fā)病表現(xiàn)為家族聚集性，諸多學(xué)者認為遺傳因素在PCOS病因?qū)W方面起重要作用。近年研究熱點關(guān)注表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，PCOS所致高雄激素血癥及胰島素血癥這兩大分泌特征以及其相關(guān)基因的研究引起學(xué)者更多的關(guān)注，從表觀遺傳學(xué)進行研究報道較少。
　　抗苗勒管激素（Anti-müllerian hormone，AMH）是卵巢顆粒細胞分泌的一種局部調(diào)節(jié)因子，目前研究發(fā)現(xiàn)其與卵泡生長發(fā)育有重要作用，AMH對PCOS局部病理變化的研

3、究主要集中在因卵巢局部調(diào)節(jié)因子的表達與調(diào)控異常而導(dǎo)致的一系列病理生理改變，而不同患者表現(xiàn)出較大差異。研究表明，AMH主要通過其相應(yīng)的受體（主要是其II型受體）發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)作用，表現(xiàn)出旁分泌局部調(diào)節(jié)參與系列的代謝途徑?？姑缋展躀I型受體（Anti-müllerian hormone receptor II，AMHRII）在PCOS卵巢局部和子宮內(nèi)膜病理變化中作用的研究鮮有報道，其在PCOS發(fā)生過程中的分子遺傳作用機制尚無描述。高胰島

4、素血癥是PCOS的另一重要病理生理特征之一，主要表現(xiàn)為臨床上的胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）近期的研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢局部及子宮內(nèi)膜等均存在著胰島素抵抗的證據(jù)，胰島素受體（Insulin receptor，INSR）成為近年來研究胰島素抵抗的重要靶點。有關(guān)胰島素抵抗發(fā)生的機理多認為與胰島素受體數(shù)目和功能相關(guān)，但實際上研究報道結(jié)論不一。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，尤其是表觀遺傳學(xué)這一領(lǐng)域的研究深入，諸多學(xué)者試圖通過

5、尋找與PCOS典型病理特征的相關(guān)基因，觀察相關(guān)基因是否存在表觀遺傳學(xué)的改變來解釋有關(guān)高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象。DNA甲基化分析是常用的手段之一，從表觀遺傳學(xué)角度分析PCOS相關(guān)基因的DNA甲基化程度有望發(fā)現(xiàn)PCOS發(fā)病機制的可能原因，因而成為近年研究PCOS的熱點。
　　本研究主要通過收集PCOS患者的臨床信息資料，描述其臨床上的基本特征，并通過與正常人群的比較，研究和分析各種PCOS臨床特征與AMHRII、INSR受體在卵巢、子

6、宮內(nèi)膜局部的定位、分布及表達，以及通過對兩種受體基因DNA甲基化的關(guān)聯(lián)性，探討PCOS高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象與表觀遺傳學(xué)關(guān)系，為進一步闡明PCOS的發(fā)病機制提供新的思路。
　　目的
　　1．通過收集PCOS患者基本信息和臨床資料，描述和分析其臨床基本特征。
　　2．采用免疫組織化學(xué)方法，分析和比較AMHR II、INSR在PCOS患者卵巢和子宮內(nèi)膜的定位、分布及表達，描述AMHRII、INSR在卵巢、子宮內(nèi)膜病理變化

7、與臨床特征的關(guān)聯(lián)性。
　　3．通過重亞硫酸鹽處理測序法定量分析AMHR II、INSR基因DNA甲基化程度與臨床特征的關(guān)系，探討DNA甲基化與PCOS臨床特征、異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象的關(guān)系，進一步闡明PCOS與表觀遺傳學(xué)的關(guān)系。
　　方法
　　1．PCOS患者臨床資料收集和分析隨機收集2014年03月—2014年12月在廣東省計劃生育專科醫(yī)院門診就診及住院的95患者為研究對象，完成問卷填寫相關(guān)信息、B超檢查和其他臨床資料

8、。
　　2．血液生殖相關(guān)激素測定采集患者月經(jīng)周期第2-4天血液，采用ELISA法檢測血清雌二醇(E2)、孕激素（P）、睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平，計算卵泡刺激素/黃體生成素(FSH/LH)比值?？崭挂葝u素（FINS）及空腹血糖（FPG）值，并計算HOMA-IR指數(shù)。
　　3．病理組織形態(tài)學(xué)分析及鑒定取卵巢、子宮內(nèi)膜組織后固定石蠟包埋，采用HE染色的方法進行病理組織形態(tài)學(xué)觀察和分析。
　　4

9、．蛋白定位表達情況分析采用免疫組織化學(xué)（Immuno-Histochemistry，IHC）方法分別標記AMHRII和INSR，觀察其在卵巢、子宮內(nèi)膜中的定位、分布。
　　5．受體基因甲基化的測定與分析采用重亞硫酸鹽處理測序法定量檢測兩組血液AMHRII、INSR基因DNA甲基化程度，軟件計算甲基化率。
　　6．統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS21軟件進行分析統(tǒng)計，分析AMHR II、INSR基因DNA甲基化程度與臨床特征的關(guān)系，以及

10、闡明PCOS與表觀遺傳學(xué)作用機制。
　　結(jié)果
　　1．PCOS患者臨床資料基本特征收集的95例PCOS患者中，臨床特征表現(xiàn)多樣化，符合PCOS臨床診斷標準；75例PCOS患者臨床特征中，表現(xiàn)月經(jīng)正常組18例，占24％；表現(xiàn)多囊卵巢改變54例，占72%；表現(xiàn)高雄激素或高雄激素體征共53例，占70.7%；表現(xiàn)胰島素抵抗48例，占64%。表現(xiàn)月經(jīng)正常組與稀發(fā)組兩組之間的比較，月經(jīng)稀發(fā)組年齡低，兩者比較有顯著性差異（P<0.05）。

11、表現(xiàn)IR組與無IR兩組之間，IR組表現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)現(xiàn)象，兩者比較有顯著性差異（（P<0.05）。
　　2．病理組織形態(tài)學(xué)HE分析 PCOS患者卵巢可見多個擴張的囊泡，顆粒細胞層數(shù)減少，間質(zhì)增生，成熟黃體少見；正常組見不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細胞層較厚，可見成熟黃體。PCOS患者組子宮內(nèi)膜增厚，腺上皮細胞增生，腺體扭曲，間質(zhì)明顯增生；正常組子宮內(nèi)膜未見明顯增生。
　　3．免疫組織化學(xué)分析AMHRII、 INSR
　　AMHR

12、II、INSR在PCOS患者組及對照組的卵巢、子宮內(nèi)膜均有表達。AMHRII、的表達主要定位于細胞膜，INSR表達主要定位在細胞漿，PCOS患者組INSR在卵巢顆粒細胞、卵巢間質(zhì)細胞均有表達。AMHRII在顆粒細胞中表達更明顯，卵巢間質(zhì)中見少量分布。對照組AMHRII、 INSR主要在未成熟卵泡顆粒細胞表達，間質(zhì)中見少量分布。PCOS患者組見INSR強陽性表達，整體高于對照組。AMHRII在卵巢中的表達稍高于對照組，INSR在PCOS及

13、對照組卵巢中表達無明顯差異，AMHRII在PCOS及對照組子宮內(nèi)膜表達無明顯差異。
　　4．重亞硫酸鹽處理測序法定量分析DNA甲基化
　　4.1 AMHR2基因DNA甲基化60例樣本AMHR2基因DNA甲基化的共檢測四個位點，其中PCOS組40例，正常組20例，其中P1、P2兩組間無顯著差異；其中P3、P4兩組間有顯著差異。在40例PCOS組內(nèi)包括①月經(jīng)稀發(fā)②高雄激素血癥或高雄激素體征③一側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊樣變?nèi)椗R床表現(xiàn)，滿

14、足其中兩項或三項癥狀齊全，共分四組，它們組間無相關(guān)性（P>0.05）；PCOS組內(nèi)不同臨床特征進行AMHRII基因甲基化程度與胰島素抵抗關(guān)系有顯著差異（R=0.532，p=0.00）。
　　4.2 INSR基因DNA甲基化60例樣本INSR基因DNA甲基化的共檢測四個位點，其中PCOS組40例，正常組20例，其中P1、P2兩組間無顯著差異；其中P3、P4兩組間有顯著差異。在40例PCOS組內(nèi)包括①月經(jīng)稀發(fā)②高雄激素血癥或高雄激素體

15、征③一側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊樣變?nèi)椗R床表現(xiàn)，滿足其中兩項或三項癥狀齊全，共分四組，它們組間不同臨床特征組間無相關(guān)性（P>0.05）；PCOS組內(nèi)不同臨床特征進行INSR基因甲基化程度與胰島素抵抗關(guān)系有顯著差異（R=0.281，p=0.03）。
　　結(jié)論
　　1．AMHRII、INSR基因DNA甲基化與PCOS臨床基本特征有相關(guān)性，與PCOS不同臨床特征組間無相關(guān)性；AMHRII、INSR基因DNA甲基化與胰島素抵抗有關(guān)聯(lián)性。

16、r>　　2．INSR受體在PCOS患者子宮內(nèi)膜中表達強陽性，而AMHRII受體表達稍高，表明AMHRII也參與子宮內(nèi)膜病變，INSR高表達可能與子宮內(nèi)膜增生有相關(guān)性。
　　3．PCOS患者卵巢中INSR在卵泡及間質(zhì)表達無明顯改變，但在間質(zhì)血管上皮表達明顯，推測可能與卵巢間質(zhì)增生有相關(guān)性。
　　4．PCOS患者臨床特征多樣化，符合PCOS臨床診斷標準，表現(xiàn)異質(zhì)性；月經(jīng)稀發(fā)與年齡低呈相關(guān)性，年齡低者月經(jīng)稀發(fā)率高；有IR者多伴有表