組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^Snail誘導肝卵圓細胞上皮-間質化.pdf

1、1944年Opie等[1]在大鼠誘發(fā)肝癌的過程中發(fā)現(xiàn)卵圓細胞，1956年Farber首次將其命名為卵圓細胞[2]，1958年Wilson等[3]推測卵圓細胞可能是肝臟的干細胞，隨后人們發(fā)現(xiàn)人體肝臟內(nèi)也存在卵圓細胞。目前普遍認為肝卵圓細胞位于肝臟的匯管區(qū)、纖維隔和 Hering管周圍。肝卵圓細胞作為肝臟的成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化的潛能，可分化成肝細胞、膽管細胞、胰腺細胞、神經(jīng)干細胞和腸型上皮細胞等[4]。肝卵圓細胞在肝臟受損

2、時被激活和增殖，有研究顯示肝卵圓細胞移植可修復損傷的肝臟，因此肝卵圓細胞參與了肝臟的修復、再生。由此可以推論提高肝卵圓細胞的分化和遷移能力可以提高其修復受損肝臟的能力。
　　上皮細胞-間質轉化（EMT）是上皮細胞丟失上皮細胞表型（如上皮細胞標志物E-cadherin）并獲得間質細胞表型（如間質細胞標志物Vimentin），以獲得自由移動能力的過程；主要包括三種：1型EMT與胚胎發(fā)育、植入及器官形成相關；2型EMT與組織再生、損傷修

3、復和器官纖維化相關；3型EMT與腫瘤生長及轉移相關。肝臟內(nèi)多種細胞可發(fā)生EMT過程，包括肝細胞、膽管細胞、肝星狀細胞和肝卵圓細胞[5]。研究顯示肝卵圓細胞的具有修復肝臟損傷作用，其發(fā)生的EMT可能有利于其修復過程。
　　組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)是一種新型的抗癌藥物，包括：①脂肪酸類，包括丁酸鈉（NaBu）；②小分子氧氧肟酸鹽類，包括二酰苯胺氧肟酸（SAHA）和曲古菌素 A（TSA）等；③親電子甲酮類；④環(huán)形肽類；⑤苯酰

4、胺類；⑥其他類化合物。最近研究顯示 HDACi可以抑制器官纖維化[6]，包括肺纖維[7]、心肌細胞纖維化[8]、腎纖維化[9]及肝纖維化等[10,11]，同時它可以通過抑制肝細胞的EMT來抑制肝纖維化，從而為治療肝硬化提供依據(jù)。
　　因此，本研究通過組蛋白去乙酰化酶抑制劑刺激肝卵圓細胞，觀察其發(fā)生EMT過程及遷移過程，探討其作用機制，以求為肝卵圓細胞修復肝臟損傷提供一種依據(jù)，同時為組蛋白去乙?；敢种苿┮种聘卫w維化提供理論依據(jù)。<

5、br>　　目的：
　　探討組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）誘導肝卵圓細胞（WB-F344）上皮-間質轉化和促使其遷移能力增強的機制。
　　方法：
　?。?）流式細胞術檢測肝卵圓細胞的干細胞標志物OV6表達情況；
　?。?）應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑（SAHA、TSA、NaBu）處理肝卵圓細胞（WB-F344），誘導其發(fā)生上皮細胞-間質轉化，觀察其形態(tài)學變化；
　?。?）MTT方法檢測SAHA對肝卵圓細胞

6、的增殖影響情況；
　　（4）采用劃痕試驗觀察SAHA對肝卵圓細胞遷移能力的影響；
　?。?）Western blot、熒光定量 PCR技術檢測肝卵圓細胞上皮細胞標志物 E鈣粘素（E-cadherin）和間質細胞標志物波形蛋白（Vimentin）的蛋白及mRNA變化情況；
　?。?）Western blot、熒光定量PCR技術檢測肝卵圓細胞發(fā)生上皮細胞-間質化過程中的轉錄因子Snail的蛋白及mRNA變化情況；
　

7、?。?）激光共聚焦技術檢測肝卵圓細胞發(fā)生上皮細胞-間質化過程中的轉錄因子 Snail入核情況；
　?。?）應用siRNA干擾Snail后，對比肝卵圓細胞SAHA刺激組及空白組的形態(tài)變化，同時Western blot檢測EMT Marker的變化。
　　結果：
　?。?）通過流式細胞術檢測顯示在培養(yǎng)過程中WB-F344細胞干細胞性能未發(fā)生改變；
　?。?）HDACi可以誘導WB-F344細胞發(fā)生上皮-間質化，包括形

8、態(tài)的改變、上皮細胞標志物E-cadherin蛋白水平及mRNA水平下調(diào)和間質細胞標志物Vimentin蛋白水平及mRNA水平上調(diào)；
　?。?）劃痕試驗顯示HDACi可以提高WB-F344細胞的遷移能力；
　?。?）在HDACi誘導肝卵圓細胞EMT過程中，可以促進EMT的關鍵轉錄因子Snail的蛋白水平和mRNA水平的增加，以及促進其核轉錄;
　?。?）siRNA干擾Snail后可以抑制HDACi誘導肝卵圓細胞EMT過程