PEI介導siRNA分子體內(nèi)外基因沉默VEGFR2表達的研究.pdf

1、RNA 干擾(RNA interference,RNAi)又稱基因沉默,是生物體內(nèi)的一種自然現(xiàn)象,其機理為:外源性或內(nèi)源性的長雙鏈RNA被核苷酶Dicer切割降解為21-23個核苷的小分子干擾RNA(siRNA)雙鏈,該siRNA分子被嵌合進含有核苷酶的多蛋白復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)中,被其中的RNA解螺旋酶解開雙鏈后的正義鏈隨后降解,由此激活的RISC復合體由該siRNA的反義鏈介

2、導,靶向與該反義鏈序列互補的mRNA,并形成新的長雙鏈RNA,然后又被Dicer酶降解為新的siRNA片段,靶mRNA即被降解或沉默,得到的siRNA進入新一輪基因沉默循環(huán)。siRNA分子的基因沉默功能相對于同為核酸類分子的反義核酸和核酶(ribozymes),特異性及沉默效應更強且無免疫原性。因此,國內(nèi)外許多研究機構迅速采用了siRNA分子技術來進行疾病治療的研究,任何與疾病有關的表達基因都是潛在的靶標。
　　 血管內(nèi)皮細胞生

3、長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)是一種酪氨酸激酶受體,由一個胞外結構域,一個跨膜結構域和一個胞內(nèi)酪氨酸激酶結構域組成,其與VEGF的信號通路在血管的形成過程中起重要作用。因此設計針對VEGFR2基因的siRNA分子來沉默其表達以阻斷VEGF/VEGFR2信號通路能夠抑制腫瘤新生血管的形成,從而具有治療腫瘤的應用前景。但是作為RNAi效應分子的siRN

4、A分子具有核酸和小分子化合物的雙重特性,當其作為基因類藥物在生物體內(nèi)應用發(fā)揮疾病治療作用時,容易被核酸酶降解,具有穩(wěn)定性差、半衰期短、細胞內(nèi)轉染效率低和靶向性差等缺點,因此,應用siRNA分子的關鍵是如何有效地使其到達靶細胞并穿過細胞膜,進入細胞質中的RNAi通路。目前siRNA分子給藥多借助載體,但存在靶向性差,安全性不明確和體內(nèi)細胞轉染效率低等問題:病毒載體基因轉染率高,但具有潛在的致痛性和免疫原性；陽離了脂質體具有較大的細胞毒性和

5、不穩(wěn)定性；陽離子聚合物由于具有較低的免疫原性和細胞毒性,而備受研究者的青睞。目前常用的是陽離子聚合物聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI),其帶正電荷的氨基基團與核酸帶負電荷的磷酸基團通過靜電吸附作用而發(fā)生電性中和,形成穩(wěn)定的納米-核酸復合物,表面電荷呈中性或弱陽性,與表面帶負電荷的細胞膜相互作用而進入細胞內(nèi),具有較高的靶向性和轉染效率。
　　 為了探索siRNA分子經(jīng)組織靶向性結構修飾后給藥的可行性,本文以未

6、修飾的PEI為載體包裹抗小鼠VEGFR2表達的siRNA分子(siVEGFR2),研究了其細胞特異性靶基因沉默效應,并在生物體內(nèi)比較了瘤內(nèi)和靜脈注射兩種不同給藥途徑對其介導的基因沉默效應以及抗腫瘤生長作用的影響,為下一步siVEGFR2分子經(jīng)組織靶向性結構修飾的優(yōu)化給藥系統(tǒng)應用于臨床治療腫瘤提供了理論和實驗基礎。
　　 目的:
　　 1.研究PEI作為siRNA分子體內(nèi)外給藥載體的可行性。
　　 2.比較瘤內(nèi)和系

7、統(tǒng)兩種給藥途徑對PEI介導siVEGFR2抑制腫瘤生長作用的影響。
　　 方法:
　　 1.制備siRNA/PEI以及siRNA/Lipofectamine2000復合物分別轉染MS1細胞,同時以單純只加空載體PEI作對照。用共聚焦顯微鏡觀察PEI/Lipofectamine2000介導的siRNA在細胞內(nèi)的亞分布。
　　 2.制備siVEGFR2/PEI以及siVEGFR2/Lipofectamine2000復

8、合物分別轉染MS1細胞,同時以單純只加空載體PEI作為空白對照組和PEI轉染不針對任何靶基因的對照siRNA作為陰性對照轉染組。分別通過半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和Western blot方法考察siVEGFR2分子轉染MS1細胞后對VEGFR2基因的RNAi效應。采用one-way ANOVA統(tǒng)計方法比較轉染各組細胞VEGFR2mRNA和蛋白表達水平是否有顯著性差異。
　　 3.皮下接

9、種一定數(shù)量的A549肺痛細胞建立裸鼠皮下腫瘤模型,等到腫瘤可觸摸時用游標卡尺定期測量腫瘤體積。腫瘤體積的計算公式為1/2×a×b2,其中a代表長直徑,b代表短直徑。當腫瘤體積達到60-70mm3時,分別腫瘤內(nèi)局部給予saline,隨即對照siRNA/PEI,siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI,以及靜脈內(nèi)給予siVEGFR2/PEI。每3天給藥1次,連續(xù)給藥5次,每次給藥前測得腫瘤體積以及荷瘤鼠

10、的體重。應用單因素重復測量方差分析比較給藥各組腫瘤體積和荷瘤鼠體重是否有顯著性差異。
　　 4.給藥結束后處死動物取出腫瘤組織,分別通過半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)和Western blot方法檢測給藥各組裸鼠腫瘤組織中VEGFR2 mRNA和蛋白的表達水平考察siVEGFR2分子的體內(nèi)基因沉默效應。采用one-way ANOVA統(tǒng)計方法比較給藥各組裸鼠腫瘤組織中VEGFR2 mRNA和

11、蛋白表達水平是否有顯著性差異。
　　 5.用抗CD31抗體進行免疫組織化學染色腫瘤組織切片,觀察各組腫瘤組織中的血管分布。
　　 6.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)檢測各組裸鼠血清中細胞因子含量。采用one-wayANOVA統(tǒng)計方法比較給藥各組裸鼠血清中細胞因子的含量是否有顯著性差異。
　　 結論:
　　 1.PEI和Lipofectamine2000都能將siRNA分子轉染進入細胞胞漿的核周區(qū)域,從而使

12、siRNA分子進入RNAi通路產(chǎn)生RNAi作用。
　　 2.體外轉染siVEGFR2至MSl細胞,能特異性沉默VEGFR2 mRNA和蛋白的表達。
　　 3.腫瘤內(nèi)給予siVEGFR2/PEI的抗腫瘤生長作用、特異性基因沉默作用以及抑制微血管生長的作用均優(yōu)于靜脈給藥途徑,說明未經(jīng)組織靶向性修飾的PEI不具有腫瘤靶向性,為進一步研究優(yōu)化該給藥系統(tǒng)提供了基礎。
　　 4.給藥各組裸鼠血清中細胞因子的含量檢測結果和給藥