實時定量PCR檢測NF-kB在急性髓系白血病中的表達.pdf

1、背景與目的
　　 核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(Nuclear factor-kappa B，NF-κ B)是一種幾乎表達于所有細胞的蛋白復合體[1]。Sen等1986年首次在成熟B細胞，漿細胞中發(fā)現(xiàn)的能與免疫球蛋白κ輕鏈增強子B點特異結(jié)合的核蛋白，并能促進κ基因表達的核蛋白因子。NF-κ B幾乎存在于所有的細胞中。NF-κ B家族包括NF-κ B1(P50)，NF-κ B2(P52)，RelA(p65)，RelB和c-Rel等，其共同點

2、是擁有一個有300個氨基酸組成的高度保守的Rel同源結(jié)構域，該區(qū)為與DNA結(jié)合、二聚體化、Iκ B相互作用及核定位信號區(qū)域。
　　 在胞漿中NF-κ B與一種抑制性蛋白Iκ B結(jié)合處于失活狀態(tài)，能被激活劑如TNF，生長因子，氧化劑，病毒，藥物等激活。被激活的κB與NF-κ B抑制蛋白(Iκ B)解離，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的κB序列結(jié)合，增強其表達。NF-κ B是一類功能廣泛的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，通過對靶基因的調(diào)控，參與機體的免疫，炎癥，

3、腫瘤的發(fā)生，細胞周期調(diào)控及凋亡等多種生物學過程[2，3]。
　　 研究顯示NF-κ B導致惡性腫瘤的發(fā)生是因為細胞因子或其受體基因轉(zhuǎn)錄的激活，促進了非調(diào)節(jié)性淋巴細胞的生長或阻斷凋亡。此外，NF-κ B直接作用于細胞周期或DNA復制也會導致惡性腫瘤的發(fā)生[4]。體外實驗表明，抑制NFκB能促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在急性髓系白血病(AML)患者存在持續(xù)活化或高活性的NF-κ B，且AML患者NF-κ B活性與其亞型

4、有關[6，7]。應用定量PCR方法檢測AML患者NF-κ B mRNA表達情況，國內(nèi)未見報道。本實驗通過實時定量PCR的方法比較正常人及AML患者NF-κ B mRNA表達水平差異，探索其在AML發(fā)病中可能的作用機制。
　　 對象與方法
　　 1研究對象：60例病例來自2008年9月-2010年3月我院住院或門診初診急性髓系白血病患者，男性28例，女性32例，平均年齡38(16-76)歲，其中M13例，M222例，M31

5、8例，M47例，M510例，正常對照為6名骨髓移植供者。
　　 2實驗方法
　　 2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄：Trizol一步法提取總RNA，檢測其完整性和濃度，反轉(zhuǎn)錄反應使用Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，反應液配制按試劑盒要求操作，反應條件：42℃60min，70℃5min，4℃5min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.2一致性檢測

6、： PCR反應體系：PCR反應液12.5μ1，cDNA模板3ul，上下游引物各0.25u l，滅菌超純水9u1，PCR反應總體積為25μl，反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性1 min，57℃退火45 sec，72℃延伸1 min的條件下循環(huán)35次，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(90V，30min)。
　　 2.3實時定量PCR擴增：PCR擴增在ABI3700實時熒光定量PCR儀上進行。TAKAR

7、A設計合成NF-κ B基因引物。上游引物序列為5'CTG AAC CAG GGC ATACCT GT3'，下游引物序列為5'GAG AAG TCC ATG TCC GCA AT3'，擴增產(chǎn)物197bp，內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5'TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3'，下游引物序列為5' TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3'，擴增產(chǎn)物206bp。PCR反應液購買于TAKARA公司的SYBR Prime

8、ScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime)，反應體系為50μl。反應條件為：94℃預變性3 min;第二階段：94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸45sec;40個循環(huán)；72℃延伸10min，間隔30s繪制溶解曲線。結(jié)果
　　 1.瓊脂糖凝膠電泳圖(見附頁)可見各組NF-κ B cDNA及內(nèi)參GAPDH擴增結(jié)果，內(nèi)參擴增條帶位于206bp左右，NF-κ B擴增條帶位于197bp左

9、右。
　　 2.NF-κ B的Real-time PCR結(jié)果：將相當于0.01～100ng總RNA的cDNA作為模板，進行實時PCR擴增，制作標準曲線和溶解曲線。由圖可知(見附頁)，NF-κ B，GAPDH擴增曲線中溶解溫度90℃和87℃左右，說明PCR擴增產(chǎn)物為單一產(chǎn)物。NF-κ B及GAPDH的標準曲線及兩者的擴增效率(Ef)基本一致。
　　 3.NF-κ B mRNA在急性髓系白血病不同亞型中的表達對目的基因和參比

10、基因的CT值進行歸一化，即△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參，各組NF-κ BmRNA表達量以(?)±s表示，由表可見實驗組NF-κ B mRNA表達高于正常對照組(P＜0.05)，應用方差分析，M4組NF-κ BmRNA表達量大于M2組(P＜0.05)，M5組大于M1，M2，M3組(P＜0.05)，余差別無統(tǒng)計學意義。結(jié)論
　　 1.NF-κ B在AML中表達升高，其表達上調(diào)在AML發(fā)病中可能起了重要作用。
　　 2.NF-κ