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文檔簡介
1、背景與目的
核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(Nuclear factor-kappa B,NF-κ B)是一種幾乎表達于所有細胞的蛋白復合體[1]。Sen等1986年首次在成熟B細胞,漿細胞中發(fā)現(xiàn)的能與免疫球蛋白κ輕鏈增強子B點特異結(jié)合的核蛋白,并能促進κ基因表達的核蛋白因子。NF-κ B幾乎存在于所有的細胞中。NF-κ B家族包括NF-κ B1(P50),NF-κ B2(P52),RelA(p65),RelB和c-Rel等,其共同點
2、是擁有一個有300個氨基酸組成的高度保守的Rel同源結(jié)構域,該區(qū)為與DNA結(jié)合、二聚體化、Iκ B相互作用及核定位信號區(qū)域。
在胞漿中NF-κ B與一種抑制性蛋白Iκ B結(jié)合處于失活狀態(tài),能被激活劑如TNF,生長因子,氧化劑,病毒,藥物等激活。被激活的κB與NF-κ B抑制蛋白(Iκ B)解離,轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的κB序列結(jié)合,增強其表達。NF-κ B是一類功能廣泛的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,通過對靶基因的調(diào)控,參與機體的免疫,炎癥,
3、腫瘤的發(fā)生,細胞周期調(diào)控及凋亡等多種生物學過程[2,3]。
研究顯示NF-κ B導致惡性腫瘤的發(fā)生是因為細胞因子或其受體基因轉(zhuǎn)錄的激活,促進了非調(diào)節(jié)性淋巴細胞的生長或阻斷凋亡。此外,NF-κ B直接作用于細胞周期或DNA復制也會導致惡性腫瘤的發(fā)生[4]。體外實驗表明,抑制NFκB能促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡[5]。近年研究發(fā)現(xiàn),在急性髓系白血病(AML)患者存在持續(xù)活化或高活性的NF-κ B,且AML患者NF-κ B活性與其亞型
4、有關[6,7]。應用定量PCR方法檢測AML患者NF-κ B mRNA表達情況,國內(nèi)未見報道。本實驗通過實時定量PCR的方法比較正常人及AML患者NF-κ B mRNA表達水平差異,探索其在AML發(fā)病中可能的作用機制。
對象與方法
1研究對象:60例病例來自2008年9月-2010年3月我院住院或門診初診急性髓系白血病患者,男性28例,女性32例,平均年齡38(16-76)歲,其中M13例,M222例,M31
5、8例,M47例,M510例,正常對照為6名骨髓移植供者。
2實驗方法
2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄:Trizol一步法提取總RNA,檢測其完整性和濃度,反轉(zhuǎn)錄反應使用Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit,反應液配制按試劑盒要求操作,反應條件:42℃60min,70℃5min,4℃5min,-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2一致性檢測
6、: PCR反應體系:PCR反應液12.5μ1,cDNA模板3ul,上下游引物各0.25u l,滅菌超純水9u1,PCR反應總體積為25μl,反應條件為:94℃預變性3 min,94℃變性1 min,57℃退火45 sec,72℃延伸1 min的條件下循環(huán)35次,72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(90V,30min)。
2.3實時定量PCR擴增:PCR擴增在ABI3700實時熒光定量PCR儀上進行。TAKAR
7、A設計合成NF-κ B基因引物。上游引物序列為5'CTG AAC CAG GGC ATACCT GT3',下游引物序列為5'GAG AAG TCC ATG TCC GCA AT3',擴增產(chǎn)物197bp,內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5'TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3',下游引物序列為5' TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3',擴增產(chǎn)物206bp。PCR反應液購買于TAKARA公司的SYBR Prime
8、ScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime),反應體系為50μl。反應條件為:94℃預變性3 min;第二階段:94℃變性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸45sec;40個循環(huán);72℃延伸10min,間隔30s繪制溶解曲線。結(jié)果
1.瓊脂糖凝膠電泳圖(見附頁)可見各組NF-κ B cDNA及內(nèi)參GAPDH擴增結(jié)果,內(nèi)參擴增條帶位于206bp左右,NF-κ B擴增條帶位于197bp左
9、右。
2.NF-κ B的Real-time PCR結(jié)果:將相當于0.01~100ng總RNA的cDNA作為模板,進行實時PCR擴增,制作標準曲線和溶解曲線。由圖可知(見附頁),NF-κ B,GAPDH擴增曲線中溶解溫度90℃和87℃左右,說明PCR擴增產(chǎn)物為單一產(chǎn)物。NF-κ B及GAPDH的標準曲線及兩者的擴增效率(Ef)基本一致。
3.NF-κ B mRNA在急性髓系白血病不同亞型中的表達對目的基因和參比
10、基因的CT值進行歸一化,即△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參,各組NF-κ BmRNA表達量以(?)±s表示,由表可見實驗組NF-κ B mRNA表達高于正常對照組(P<0.05),應用方差分析,M4組NF-κ BmRNA表達量大于M2組(P<0.05),M5組大于M1,M2,M3組(P<0.05),余差別無統(tǒng)計學意義。結(jié)論
1.NF-κ B在AML中表達升高,其表達上調(diào)在AML發(fā)病中可能起了重要作用。
2.NF-κ
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