Glypican-3適配子對肝癌診斷價值的研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝癌的篩查性診斷主要依賴甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）及影像學檢查，但效果不理想。30％～40%肝癌患者血清AFP呈陰性，小肝癌多為AFP陰性肝癌，且影像學診斷具有一定的困難。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）在肝癌組織呈特異性高表達，并可釋放入血作為肝癌標志物，對肝癌的篩查性診斷可能具有良好的應用價值。目前一般采用免疫學方法測定血清GPC3水平，因其檢測敏感性差而難以

2、臨床轉化應用。適配子是生物分子的人工核酸配體，具有與靶標高特異性、高親和力結合的特點，用于疾病診斷具有良好的應用前景。本課題組在前期研究中通過指數富集的配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）成功篩選出一批GPC3適配子，并建立了基于熒光分析的適配子診斷應用技術。本研究將在前期工作基礎上進一步評價這些適配子在肝癌診斷中的價值，以期為

3、肝癌的診斷開辟新途徑。
　　方法：
　　1．血清標本及臨床資料收集：收集南昌大學第一附屬醫(yī)院2013~2014年就診的原發(fā)性肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者及參加健康體檢的正常人血清標本，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占ㄐ詣e、年齡、肝功能、血清腫瘤標志物、影像學檢查、病理檢查等臨床資料。
　　2.GPC3適配子對肝癌診斷價值的初篩分析：人工合成20個GPC3適配子，將它們分別與肝癌、肝硬化血清標本各48例孵育，測定孵育前后的熒光值

4、，通過受試者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲線評價單項熒光指標和多項熒光指標Logistic回歸建模對肝癌的診斷價值，優(yōu)選2個對肝癌診斷價值最佳的適配子進行后續(xù)研究。
　　3．GPC3適配子診斷肝癌的實驗條件優(yōu)化：以不同的適配子用量和核酸染料用量組合成6種實驗條件，在各種條件下將優(yōu)選出的2個GPC3適配子分別與肝癌、肝硬化血清標本各32例孵育，測定孵育前后的熒光值，ROC曲線評

5、價各條件下適配子對肝癌診斷的價值，以診斷價值最大者為最佳實驗條件。
　　4．適配子對肝癌診斷價值的評價：在最佳實驗條件下，用優(yōu)選出的2個適配子分別與小樣本肝癌、肝硬化血清標本（各80例）孵育，測定孵育前后的熒光值，ROC曲線分析單指標及多指標Logistic回歸分析建模對肝癌的診斷價值。將單指標ROC曲線下面積（Area under ROC curve，AUROC）達到0.8、多指標達0.9以上的適配子擴大樣本量及樣本類型進行分析

6、（肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清標本例數各100例以上）。ROC曲線分析單項熒光指標、多項熒光指標Logistic回歸建模、適配子聯合聯合建模對肝癌的診斷價值，并計算適配子對肝癌的診斷效率（敏感度、特異度、準確度、預測值和似然比）。
　　5．血清GPC3的ELISA檢測及診斷價值評價：以商業(yè)化的人GPC3的酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒同步檢測肝癌、肝硬化

7、各80例血清標本中的GPC3濃度，評價其對肝癌診斷價值。
　　6．血清腫瘤標志物對肝癌的診斷價值：收集各標本的血清AFP、CEA、CA125和CA19-9檢測結果，ROC曲線評價標志物單項和聯合分析對肝癌的診斷價值。
　　結果：
　　1．GPC3適配子對肝癌診斷價值的初篩結果及適配子檢測肝癌的最優(yōu)條件：20個適配子中，9個適配子單項熒光指標診斷肝癌的最大AUROC達0.8以上；16個適配子多項熒光指標聯合分析診斷肝癌的

8、AUROC達0.9以上，其中AP-GPC3-13、AP-GPC3-27兩個適配子的AUROC分別為0.999與0.995，為優(yōu)選適配子。兩個優(yōu)選適配子AP-GPC3-13、AP-GPC3-27在適配子及核酸染料用量分別在0.3pmol、2.5μL及0.5pmol、2.5μL條件下診斷肝癌的價值最大，為最佳條件。
　　2.GPC3適配子對肝癌的診斷價值：小樣本血清標本（肝癌、肝硬化各80例）分析上述2個優(yōu)選適配子對肝癌診斷價值，最佳

9、單指標AUROC分別為0.852及0.884，優(yōu)于AFP；多指標聯合分析AUROC均為0.9以上，明顯優(yōu)于AFP。擴大樣本（肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清分別為144、158、126、100例，肝硬化、慢性肝炎與正常合并為非肝癌組）評價2個適配子對肝癌的診斷價值，最佳單指標診斷肝癌與非肝癌的AUROC為0.75左右，多指標聯合檢測為0.9左右。2個適配子聯合分析診斷肝癌與非肝癌的AUROC、敏感度、特異度、準確度均達0.9以上，優(yōu)于單一適

10、配子。
　　在55例小肝癌（≤3cm）中，兩個適配子的檢測陽性率分別為63.6%和49.1%，高于AFP（43.6%）；兩者聯合分析陽性率進一步提高，達74.5%。在68例AFP陰性肝癌，兩個適配子的檢測陽性率分別為70.6%和69.1%，兩者聯合分析達83.8%。
　　3．ELISA檢測血清GPC3對肝癌的診斷價值：肝癌組的血清GPC3水平為1.22±3.07ng/mL，肝硬化組的血清 GPC3水平為1.36±3.35ng

11、/mL，兩組間差異無統(tǒng)計學意義，診斷肝癌的AUROC為0.575。
　　4．腫瘤標志物對肝癌的診斷價值：在4組血清標本中，只有 AFP對肝癌具有一定的診斷價值，診斷肝癌與非肝癌的AUROC為0.761，其他腫瘤標志物（CEA、CA125、CA199）無明顯診斷價值，4種腫瘤標志物聯合診斷肝癌的AUROC無明顯增加。
　　結論：
　　1．GPC3適配子對肝癌具有良好的診斷價值，明顯優(yōu)于血清GPC3和AFP檢測對肝癌的診斷