胃癌相關抗原MG7-Ag的鑒定和功能分析.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居腫瘤的第二位。對胃癌的早期診斷和治療是胃癌研究的重大課題。胃癌早期無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時已到晚期，預后極差。以往的胃癌標志物如CEA、CA50等對胃癌的敏感性和特異性較低，早期診斷受到限制。因此，尋找新的組織學、細胞學、血清學的胃癌新抗原，對胃癌診治的意義重大。
　　本實驗室樊代明教授在上世紀八十年代研制出一系列胃癌單克隆抗體，命名為MG系列。其中，MG7-Ag對胃癌的敏感性特異性都很高。后續(xù)本實

2、驗室及國內醫(yī)學專家對此進行了一系列相關深入的研究，包括胃癌單克隆抗體MG7對胃癌的診斷、評價預后及動態(tài)監(jiān)測作用、MG7靶向治療作用、特異性納米疫苗的制備等等，在國內外發(fā)表了幾十篇很有影響力的文章。
　　但是，MG7-Ag尚未可知，MG7單抗在國際上的推廣及進一步研究受到限制。香港科技大學學者鑒定MG7-Ag為hnRNPA2?B1，但是其性質與我們的以往研究的MG7-Ag不符。本研究使用免疫沉淀、雙向電泳、質譜分析等技術鑒定MG7-

3、Ag，對于發(fā)現(xiàn)新的癌抗原或癌蛋白，對于胃癌新的分子機制的研究有著不可估量的重要意義。
　　此外，本研究擬建立一個簡便的胃癌血清學早期診斷方法，用于胃癌高危人群的普查。MG7單抗對胃癌細胞凋亡作用的研究，為今后的臨床藥物治療提供新的思路。
　　總之，本項研究有深刻的理論意義和臨床應用前景。
　　【目的】
　　1、免疫組織化學檢測MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達與分布特點及與臨床特征的聯(lián)系；2、研究MG7-Ag與hn

4、RNPA2/B1的表達區(qū)別；3、MG7-Ag的鑒定；4、建立檢測MG7-Ag的簡便的胃癌血清學早期診斷方法；5、MG7單抗對胃癌細胞凋亡及細胞周期的影響。
　　【方法】
　　1、通過細胞培養(yǎng)技術復蘇MG7雜交瘤細胞，制備MG7單抗；2、應用免疫組化技術檢測MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達與分布特點及與臨床特征的聯(lián)系；3、應用免疫組化技術觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌組織中的表達區(qū)別；4、應用免疫細胞化學技術和掃

5、描共聚焦顯微鏡觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞中的表達區(qū)別；5、通過Westernblot技術檢測MG7-Ag與hnRNPA2/B1胃癌細胞中的表達區(qū)別；6、應用免疫沉淀，Westernblot，雙向電泳，質譜技術鑒定MG7-Ag；7、通過酶聯(lián)免疫吸附方法建立檢測MG7-Ag的胃癌血清學早期診斷方法；8、通過MG7-Ag的胃癌血清學早期診斷方法檢測胃癌，胃癌前病變和其它各種腫瘤病人；9、流式細胞儀檢測MG7抗體對胃癌細胞

6、凋亡和細胞周期的影響。
　　【結果】
　　1、MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達與分布及與臨床特征的聯(lián)系
　　檢測了MG7-Ag在胃粘膜組織（胃癌116例；淺表性胃炎，腸化，增生、萎縮性胃炎等84例）石蠟組織標本中的表達與分布情況，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag陽性表達率是隨著淺表性胃炎，腸化，增生，胃癌，逐漸增高的。MG7-Ag陽性分布：1.腺上皮細胞的胞漿上極和胞膜；2.胃腺腔內。胃癌旁切片染色提示：胃黏膜腺體底部上皮細胞MG7-

7、Ag幾乎全部陽性，向頂端方向陽性細胞漸減少，而頂端腔面上皮細胞MG7-Ag又多為陽性。在胃癌患者中，MG7-Ag表達與年齡、性別無關，與分化和臨床分期有關。
　　2、MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞中表達存在明顯區(qū)別
　　我們應用免疫組化技術檢測同一胃癌石蠟切塊中MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag主要分布在細胞膜，細胞核中未見陽性表達，而hnRNPA2/B1主要分布在細胞核中。

8、應用免疫細胞化學技術和掃描共聚焦觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞SGC7901，MKN45中的表達區(qū)別，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag主要分布在細胞膜上，細胞核中未見陽性表達，而hnRNPA2/B1主要分布在細胞核中。通過Westernblot技術檢測MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞MKN45中的區(qū)別，MG7-Ag表現(xiàn)為2條帶，分子量分別約100KD、120KD；hnRNPA2/B1表現(xiàn)為2條帶，分子量分別約34KD、37

9、KD。
　　3、MG7-Ag的鑒定
　　我們通過免疫沉淀方法，將MG7抗體分別與胃癌細胞系SGC7901，MKN45，胃癌組織交聯(lián)，行單向或雙向電泳。與Westernblot相匹配的蛋白點從銀染或考馬斯亮藍染色的膠中切下，轉到離心管中做質譜檢測。
　　免疫沉淀的單向電泳，銀染的表觀分子量為100KD的胃癌組織條帶和胃癌細胞系MKN45條帶，LC-MS/MS分析鑒定最可能為anti-colorectalcarcinoma

10、heavychain；考馬斯亮藍染色的表觀分子量為100KD的胃癌細胞系MKN45條帶和SGC7901條帶，ESI-MS/MS分析鑒定最可能為anti-humanCD19monoclonalantibody4G7immunoglobulingamma1heavychain。
　　免疫沉淀的雙向電泳，考馬斯亮藍染色的表觀分子量為100KD的胃癌組織條帶，MALDI-TOF/TOF分析鑒定為IGHG3protein。通過Western

11、blot技術，抗人IgG抗體可以與MG7-Ag結合，說明MG7-Ag可能為免疫球蛋白重鏈樣分子。
　　4、研發(fā)檢測MG7-Ag的胃癌血清學早期診斷方法及應用
　　應用間接酶聯(lián)免疫吸附方法，生物素-親和素放大系統(tǒng)，選擇合適的包被條件和抗體濃度，檢測胃癌手術前后，胃癌前病變和其他腫瘤患者的血清中MG7-Ag。PBS（0.01M）為陰性對照。大于陰性對照的A值的2.1倍為陽性。116例胃癌術前患者的陽性率為83.6％，明顯高于胃癌

12、術后（總63例，47.6％），胃癌前病變（總78例，12.8％）和其它腫瘤組。統(tǒng)計學分析差別有顯著意義（P<0.01）。MG7-Ag在其他腫瘤患者血清中也有不同程度的陽性表達，如肺癌（45.2％），直腸癌（45.5％），結腸癌（17.6％），乳腺癌（14.2％），而子宮癌，淋巴瘤，急性白血病患者中未檢測出。胃癌術前患者血清檢測MG7-Ag的的陽性表達率隨著TNM分期進展逐漸升高：Ⅰ期（總6例，33.3％），Ⅱ期（總46例，78.3％），

13、Ⅲ期（總62例，91.9％），Ⅳ期（總2例，100％），統(tǒng)計學顯示各組間差別有顯著意義（P<0.01）；N0（總30例，60.0％），≥N1（總86例，91.9％），統(tǒng)計學顯示差別有顯著意義（P<0.01）。以上結果提示，MG7-Ag是胃癌較特異性的標志，MG7-Ag的表達率隨胃癌的進展而升高。間接酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測患者血清MG7-Ag可以作為胃癌的早期診斷的簡便方法。
　　5、MG7單抗對胃癌細胞凋亡及細胞周期的影響。

14、　　應用流式細胞儀檢測MG7單抗對胃癌細胞系KATOⅢ的凋亡影響，發(fā)現(xiàn)MG7單抗明顯促進胃癌細胞的早期凋亡(P<0.05)。細胞周期檢測，MG7單抗主要使胃癌細胞阻滯在G1期。
　　【結論】
　　本研究提示：MG7-Ag的表達水平與胃癌的分期和惡性程度相關，可能在胃癌的發(fā)生和進展中起重要的作用；MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細胞表達中存在明顯區(qū)別，MG7-Ag是hnRNPA2/B1的可能性不大；MG7-Ag可能為免