GADD153參與調(diào)控視網(wǎng)膜脫離后細胞凋亡的研究.pdf

1、目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑的轉(zhuǎn)錄因子GADD153是否參與調(diào)控視網(wǎng)膜脫離后的細胞凋亡過程。 方法:設計針對GADD153的有效RNA干擾片段，陽性克隆經(jīng)過DNA測序鑒定后，進行慢病毒小量包裝。慢病毒滴度測定后，用RT-PCR和Western方法在體外培養(yǎng)的293T細胞中進行有效靶點的篩選，構(gòu)建以RHO為啟動子的RNAi慢病毒載體。將GADD153-shRNA的慢病毒載體采用視網(wǎng)膜下注射和玻璃體腔內(nèi)注射的方式轉(zhuǎn)入Wistar大鼠

2、眼內(nèi)，通過熒光體視鏡，熒光顯微鏡等分別在活體、眼杯鋪片和冰凍切片上觀察GFP的表達情況。124只大鼠隨機分為正常對照組（Z組）4只，視網(wǎng)膜脫離組(R組)40只，陰性病毒載體對照組（D組）40只和GADD153-shRNA慢病毒載體組（G組）40只。D組和G組雙眼采取視網(wǎng)膜下注射的方式將病毒轉(zhuǎn)入眼內(nèi)，14d后與R組一起行視網(wǎng)膜下注射10mg/ml 透明質(zhì)酸鈉制造視網(wǎng)膜脫離模型。在視網(wǎng)膜脫離后1d、2d、4d、6d摘除眼球制作石蠟病理切片或

3、取視網(wǎng)膜組織，用半定量RT-PCR 檢測GADD153、Bcl-2和Bax mRNA的表達；用Western blot檢測GADD153、Bcl-2和Bax蛋白水平的表達；運用熒光TUNEL 聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡檢測視網(wǎng)膜的細胞凋亡情況；運用免疫熒光聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡檢測GADD153 在視網(wǎng)膜的表達與分布。 結(jié)果:DNA測序鑒定顯示重組質(zhì)粒中含有所設計的寡核昔酸單鏈，序列正確。轉(zhuǎn)染Lv-GADD-Sh-2的293T細胞中GA

4、DD153蛋白質(zhì)及基因表達水平顯著下降，Lv-GADD-Sh-2抑制GADD153表達的作用最強。成功構(gòu)建了以RHO為啟動子的針對GADD153的慢病毒RNAi載體。視網(wǎng)膜下注射較玻璃體腔內(nèi)注射更有效，視網(wǎng)膜下注射組7d即能看到GFP表達，14d時表達到高峰且轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜外層，2M時仍有表達，玻璃體腔內(nèi)注射組28d才有很微弱表達。與視網(wǎng)膜脫離組和陰性病毒載體對照組相比，GADD153-shRNA慢病毒載體組的GADD153和Bax的mR