幽門螺桿菌細胞毒素相關基因A蛋白（CagA）致病的分子機制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)是一種可長期定植于人類胃粘膜的革蘭氏陰性螺旋形微需氧菌，在全世界范圍內感染率超過50％。H．pylori是引起慢性胃炎和胃十二指腸潰瘍的致病因子，流行病學和動物實驗證實H．pylori慢性感染是導致胃癌的重要危險因素。H．pylori作為致病因子的特點雖已得到公認，但有關其致病的分子機制及感染結局多樣性的本質仍未闡明。細胞毒素相關基因A蛋白(Cytotoxin-ass

2、ociated gene A，CagA)是H．pylori重要的毒力因子之一，可經cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入宿主細胞，通過依賴和或獨立于磷酸化的機制，與宿主細胞涉及調控細胞生長和運動的多種蛋白相互作用，導致細胞功能異常。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，CagA陽性H．pylori菌株感染比CagA陰性菌株更易增加十二指腸潰瘍和胃癌等嚴重胃腸疾病發(fā)生的危險性，提示CagA蛋白可能與H．pylori的致病作用有關。分析H．pylori感染引起極化

3、的單層上皮細胞基因水平的表達變化發(fā)現(xiàn)，超過90％的受影響基因依賴于cag致病島的作用，而在依賴于cag致病島的基因中有79％與CagA有關。因此，CagA可能是一種特殊的疾病相關蛋白，在H．pylori致病過程中發(fā)揮重要作用，進一步研究CagA蛋白的生物學功能及其參與H．pylori致病的機制，對于揭示H．pylori復雜的致病效應的本質及闡明其致癌的分子機制具有重要意義。 本研究從不同側面就CagA的生物學功能及其致病的分子機

4、制進行探討：首先，以臨床分離株MEL-Hp27為研究對象，克隆全長cagA基因，并對其進行分子特征分析；然后，參考cagA基因全長序列，構建cagA基因敲除突變株(Hp27/△cagA)，通過比較遺傳背景相同的野生株與突變株生物學特性差異及其對宿主細胞增殖和凋亡的影響，初步評價與cagA基因相關的生物學作用及其在細胞水平的毒性效應；最后，利用蛋白質組學方法比較野生株與突變株的菌體總蛋白表達譜差異，以及野生株與突變株攻擊胃粘膜上皮細胞Ge

5、s-1而引起的細胞總蛋白表達譜差異，篩選并鑒定與cagA基因有關的功能蛋白，為揭示CagA參與H．pylori致病過程的分子機制，探索其與胃癌的相關性提供實驗依據。 實驗方法： 1 H．Pylori的培養(yǎng)及基因組DNA的制備將H．Pylori國際參考株NCTC11637和本室臨床分離株MEL-Hp27(Hp27)分別接種于布氏平板上，37℃微需氧條件下培養(yǎng)。3天后收獲H．Pylori，抽提基因組DNA。 2 Hp

6、27 eagA基因克隆 2．1 引物設計及PCR擴增參考H．Pylori 26695基因組序列，分別針對cagA基因編碼區(qū)保守序列和位于cagA基因上、下游的結構基因序列設計兩對PCR引物，交叉分段擴增包括cagA基因編碼區(qū)、5′、3′非編碼區(qū)在內的Hp27全長cagA基因序列。 2．2 cagA基因分子特征分析將測序獲得的cagA基因全長序列，登錄GenBank數(shù)據庫，對分離白不同地區(qū)的cagA基因編碼序列進行系統(tǒng)發(fā)生

7、樹分析；并且比較cagA基因5′、3′非編碼區(qū)序列特征；在東亞地區(qū)分離株中選擇臨床背景清楚的菌株對其CagA分子氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。 3 eagA基因打靶載體的構建 3．1參考Hp27cagA基因測序結果，PCR擴增cagA基因編碼區(qū)兩側翼序列，作為同源臂片段，并從pEGFP-N2質粒上擴增卡那霉素抗性基因完整編碼區(qū)(km<'R>)作為篩選標記。 3．2將km<'R>連接于兩同源臂片段之間，共同插人到p

8、Bluescript SK Ⅱ(-)載體的多克隆位點中，構建出帶卡那霉素抗性標志的打靶載體pBSK-cagA-mutant。 4 cagA基因敲除突變株的構建與鑒定 采用電穿孔法將打靶載體pBSK-eagA-mutant轉化入受體菌株Hp27中，在普通布氏平板上培養(yǎng)48h，而后轉涂于含卡那霉素(25μg/ml)的布氏平板上繼續(xù)培養(yǎng)3～6天，篩選出cagA基因敲除突變株(Hp27△cagA)，并經PCR及測序驗證。

9、 5 cagA基因敲除突變株Hp27△cagA的生物學特性分析 5．1應用尿素酶試劑，檢測cagA基因敲除突變株Hp27△cagA與野生株Hp27的尿素酶活性差異，以國際參考株NCTC11637為陽性對照。 5．2采用0.3％半固體瓊脂穿刺法比較突變株與野生株的移行能力差別。 5．3以細胞與細菌粘附實驗來評價突變株與野生株的粘附作用差異。 5．4突變株和野生株攻擊Hela細胞，國際參考株NCTC11637

10、為陽性對照，鏡下觀察細胞空泡樣變，并結合中性紅攝入法定量檢測各組空泡毒素活性。 6 cagA．基因敲除突變株Hp27△cagA在細胞水平的毒性效應 6．1野生株、突變株分別與BGC823細胞共培養(yǎng)，在6h、12h、24h和48h觀察細胞形態(tài)學變化。 6．2采用四唑藍(MTT)比色法檢測野生株與突變株對BGC823細胞增殖活性的影響。 6．3流式細胞儀檢測野生株、突變株與BGC823細胞共培養(yǎng)48h的細胞凋

11、亡情況。 7 蛋白質組學方法 7．1樣品制備及濃度測定 收獲H．Pylori野生株與cagA基因敲除突變株，采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取野生株與突變株菌體總蛋白備用；分別將含有野生株與突變株的細菌懸液加入細胞培養(yǎng)瓶中，與胃粘膜上皮細胞Ges-1共培養(yǎng)，野生株組和突變株組細菌與細胞的比例均為100:1，10 h后收集Ges-1細胞，并采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取細胞總蛋白備用

12、；Bradford法對細菌和細胞總蛋白進行定量。 7．2雙向電泳、圖像分析、MALDI-TOF質譜分析和蛋白質鑒定應用 等電聚焦(IEF)電泳和十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術將野生株與突變株菌體總蛋白，及野生株與突變株分別攻擊的Ges-1細胞總蛋白分離，得到蛋白的雙向電泳圖譜；用GS-800圖像掃描儀獲得凝膠圖像，經PDQuest軟件分析篩選差異表達的蛋白質點；從制備型凝膠上挖下蛋白質點，膠內

13、酶解后，經基質輔助電離解析飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析獲得蛋白質點的肽質量指紋圖譜(PMF)，搜尋蛋白質數(shù)據庫并聯(lián)合生物信息學，鑒定蛋白質及分析其生物學功能。 7．3質量控制差異 蛋白質點的選擇與確定，是利用標準化后蛋白質點的體積進行比較分析，對具有統(tǒng)計學意義的蛋白質點才作為進一步研究的對象。為保證雙向電泳的重復性，對每個樣品的蛋白質電泳圖至少重復三次。 8 統(tǒng)計學分析 應用統(tǒng)計軟件SPS

14、S11.0分析所有數(shù)據，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組之間的比較采用t檢驗，多組之間的比較根據資料特點相應采用單因素方差分析或重復測量的方差分析。檢驗水準取a=0.05。 結論 1、克隆幽門螺桿菌MEL-Hp27全長cagA基因，發(fā)現(xiàn)除cagA基因編碼區(qū)序列外，cagA基因調控序列也存在東、西方地區(qū)性差異；系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn), 東亞分離菌株可以按CagA分子氨基酸序列特征分為包含胃癌分離株和不包含胃癌分離株的

15、兩個菌株群。 2、以源自中國的臨床分離株為基礎，構建cagA基因敲除突變株，為研究幽門螺桿菌中國株cagA基因的功能奠定實驗基礎。 3、首次發(fā)現(xiàn)cagA基因敲除會抑制H.pylori的尿素酶活性，并會造成H.pylori的移行能力下降，該作用可能是cagA基因參與H.pylori致病過程的機制之一。 4、cagA基因可能是H.pylori抑制宿主細胞增值所必需的成分，該基因的敲除使H.pylori對細胞增值的抑制

16、作用消失。 5、首次發(fā)現(xiàn)cagA基因與H.pylori的抗氧化應激蛋白(烷基過氧化氫物還原酶、超氧化物歧化酶和藥物活性調控因子)的表達有關，cagA基因可能直接或間接的影響H.pylori抗氧化應激蛋白的表達，從而對于維持H.pylori正常的抗氧化應激能力進而確保其在宿主胃內持續(xù)定植非常重要，這可能是CagA參與H.pylori致病的機制之一。 6、首次在H.pylori作用的胃粘膜上皮細胞總蛋白表達譜中，發(fā)現(xiàn)與cag