SATB1在非小細胞肺癌中表達的初步研究.pdf

1、肺癌（lung cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤死亡的首位，嚴重威脅著人類的健康和生命。肺癌的病理類型包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，非小細胞肺癌占肺癌總數的80％～85％，其中大部分是腺癌和鱗癌。肺癌仍然是個高致死性疾病，約一半的病例發(fā)生于發(fā)展中國家。根據美國國家癌癥研究所進行的監(jiān)測，傳染疾病和最終結果（SEER）項目所提供的數據顯示肺癌5年生存率為15％。大量研究表明，轉移是導致肺癌病人病死率高的最主要因素，

2、然而其分子機制并不明確。 研究癌變機制，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過程一直是腫瘤研究的重要課題。1991年，Liotta提出腫瘤細胞浸潤轉移三步驟學說，該過程從分子水平上可以分為三個階段：第一，粘附：腫瘤細胞之間的粘附力下降和腫瘤細胞與細胞外基質之間的粘附；第二，降解：腫瘤細胞和宿主細胞分泌的蛋白水解酶，使腫瘤細胞周圍的細胞外基質發(fā)生降解；第三，移動：腫瘤細胞被生長因子及趨化因子誘導，向縱深運動。由此腫瘤細胞可以到達身體的任何部位，錨定、

3、克隆，從而產生轉移病灶。Minna通過前瞻性地對肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中分子病理學研究，提出一整套基因變異模式，即3P基因丟失→9P基因丟失及ras基因突變→原位癌（p53，17p13．3基因突變）→肺癌侵襲或轉移（p15、p16、C-myc、c-erB2、EGFR基因突變）。隨著科學技術的發(fā)展，對肺癌的研究進一步深入，普遍認為肺癌發(fā)生發(fā)展存在多步驟、多階段、多途徑，涉及多基因變化、多種分子機制，是一個多因素、綜合調控的極為復雜的系統(tǒng)變化過

4、程。因此對于肺癌轉移機制及相關因子的研究是目前研究者關注的熱點。 核基質結合區(qū)結合蛋白質1-SATB1，是一種組織特異性表達的核基質結合蛋白。它含有兩個CUT基序，可以通過形成類似PDZ結構的二聚體，以非常高的親和力與核基質結合區(qū)序列相結合。從而影響DNA環(huán)的構建，參與了包括染色體重塑、組蛋白乙?；?、甲基化等過程，并與DNaseⅠ超敏感位點具有密切的相關性。SATB1主要在胸腺細胞中顯著表達，對T細胞的正常發(fā)育具有非常重要的意義

5、，可以協(xié)調T細胞發(fā)育各個階段的基因正常有序的表達。SATB1參與基因的轉錄抑制，SATB1對c-myc癌基因的表達亦產生影響，從而影響到了CD4+和CD8+細胞的成熟。 研究發(fā)現(xiàn)SATB1在乳腺癌進展過程中起到了關鍵性作用，通過限定多個基因組的位點和補充染色質修飾酶來調節(jié)染色質的結構和基因表達。其在惡性程度高的原發(fā)性乳腺癌樣本高表達，而與淋巴結的狀態(tài)無關；并發(fā)現(xiàn)SATB1能影響涉及腫瘤發(fā)生的多個方面的1000余個基因的表達，它顯

6、著地改變了乳腺癌細胞的基因表達譜，直接上調與細胞轉移有關的基因，同時下調抑癌基因，誘導其出現(xiàn)侵襲性表型，從而促進腫瘤生長和轉移。因此，研究者提出SATB1這種核基質結合蛋白擔任了“基因組組織者”的角色的一種新的基因調節(jié)模式。 采用SYBR GreenⅠ QRT-PCR（quantitatie realtime PCR）技術對靶基因進行實時熒光定量分析是近年來發(fā)展起來的一項新技術。SYBR GreenⅠ是一種能與雙鏈DNA結合發(fā)光

7、的熒光染料，使引物設計較簡單，且成本相對較低。它的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系中存在的雙鏈DNA數量，對靶基因進行定量分析，準確性和靈敏性都比普通RT-PCR高，并且通過熔解曲線的分析，排除非特異性擴增的干擾。通過2-ΔΔCT方法利用SYBR GreenⅠ QRI-PCR技術能夠很好的分析基因表達相對差異。用2-ΔΔCT方法分析基因表達相對定量的方法效果確切，由于這種方法無需做標準曲線，因此比絕對

8、定量方法更加簡便可行。實時熒光定量RT-PCR技術具有檢測范圍寬，敏感性高，精確度高，污染少，產出率高，可以進行多重檢測的顯著優(yōu)越性。其應用范圍涉及到DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個領域。使其在基礎研究和分子學診斷領域受到青睞，是當今研究mRNA表達水平最熱門的技術之一。 目前國內外關于SATB1研究并不多見，雖然國外有研究表明SATB1在某些惡性腫瘤中有重要價值，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，

9、但對于SATB1與肺癌的關系尚沒有確切的報道。本實驗擬通過運用實時熒光定量RT-PCR技術，以非小細胞肺癌組織和正常肺組織為研究組和對照組，在mRNA水平上檢測各組織SATB1mRNA表達情況，旨在發(fā)現(xiàn)其在不同組織中的表達差異。收集我院2007年9月-2008年9月行手術切除的肺組織標本，其中非小細胞肺患者42例，包括腺癌29例，鱗狀細胞癌13例；正常組織16例。手術切下組織后取下標本迅速保存于1 ml RNAlater中，于4℃放置過

10、夜后倒棄保護液，再轉移到-196℃液氮保存。應用TRIZOL試劑盒，按說明書要求提取總RNA，再按要求逆轉錄成cDNA，以實時熒光定量RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌組織及正常組織中SATB1 mRNA的表達。 實驗數據應用2-ΔΔCt進行處理，計算各樣本平均CT值和ΔCT值（△Ct=CtSATB1-Ctβ-actin），計算2-ΔΔCt（ΔΔCt：ΔCt目的樣本-△Ct參照樣本），其數值用于表示目的值相對于參照值的相對倍數，采

11、用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量數據以x±s表示，采用t檢驗及方差分析，P<0．05為差異有顯著性。結果發(fā)現(xiàn)，SATB1mRNA在癌組織中的表達水平比正常組織明顯上調，表達量為正常組織13．27倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0．01），提示SATB1基因表達與NSCLC的發(fā)病有一定關聯(lián)性。SATB1mRNA在非小細胞肺癌組織的表達水平在性別、年齡、組織學類型中無統(tǒng)計學差異（P>0．05），表明SATB1基因的表達在非小細胞肺癌

12、中受這些因素的影響不明顯；但與臨床分期、病理分級、淋巴結有無轉移情況顯著相關（P<0．01），其中Ⅱ期和Ⅲ期肺癌分別是Ⅰ期肺癌的2．53倍和5．04倍，中分化組和低分化組分別是高分化組2．31倍和4．26倍，淋巴結轉移組和非轉移組分別為正常組織23．63倍和5．57倍，提示SATB1基因表達與NSCLC的發(fā)展及侵襲相關聯(lián)，有望成為非小細胞肺癌預后判斷的指標。 總之，本試驗通過運用實時熒光定量RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌及正常