基于生物發(fā)光成像技術的淋巴瘤動物模型構建研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：慢病毒載體介導螢火蟲熒光素酶基因轉染EL4細胞的實驗研究
　　 目的：制備穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶(luciferase)的小鼠T細胞白血病/淋巴瘤細胞系(EL4)，并觀察熒光素酶基因在EL4細胞內的表達情況，在細胞水平檢測其生物發(fā)光能力。
　　 方法：通過陽離子脂質體法將含熒光素酶(Luc)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組慢病毒表達載體質粒pF12-luc2、包裝結構質粒

2、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和包膜蛋白質粒pMD2.G 四質粒系統(tǒng)共轉染入病毒包裝細胞293T，24h 后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，監(jiān)測轉染效率。72h 收集病毒上清，濃縮后以MOI ﹦8感染EL4細胞，在熒光顯微鏡下和應用流式細胞儀(FACS)觀察感染情況。通過流式細胞分選儀無菌條件下篩選出表達綠色熒光蛋白的EL4細胞，進行大規(guī)模擴增培養(yǎng)并對轉染前后的細胞進行生物特性分析和比較。在體外用活體成像技術(in vi

3、voimaging)評價其穩(wěn)定發(fā)光能力。
　　 結果：慢病毒載體的四質粒系統(tǒng)轉染293T細胞24h 后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達，病毒滴度測定為8.4×10 7TU/ml。感染EL4細胞后，熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達，F(xiàn)ACS分析轉導效率為96.5[％]。篩選轉染后的穩(wěn)定克隆并擴增細胞，分析其生物學特性(形態(tài)，倍增時間及生長曲線)與EL4細胞無明顯差異(P>0.05)?；铙w成像系統(tǒng)分析感染后的EL4細胞釋放的光子量

4、與細胞數(shù)量成正相關(R2=0.9896)。
　　 結論：本研究表明螢火蟲熒光素酶基因已穩(wěn)定轉染入EL4細胞，并為下一步的生物發(fā)光動物模型的構建提供實驗基礎。
　　 第二部分：生物發(fā)光淋巴瘤動物模型的構建
　　 目的：采用生物發(fā)光成像技術監(jiān)測穩(wěn)定高表達熒光素酶報告基因的淋巴瘤細胞在小鼠體內生長及轉移的情況，為研究血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供有用的模型。
　　 方法：體外擴增穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和熒光素酶的小鼠T細胞

5、白血病/淋巴瘤細胞(EL4-GFP-luc2)，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光表達情況并檢測細胞熒光素酶活性；C57BL/6小鼠皮下接種EL4-GFP-luc2細胞，建立皮下移植瘤模型；尾靜脈接種EL4-GFP-luc2細胞，以建立EL4小鼠實驗轉移模型；觀察小鼠腫瘤生長能力，小鼠成瘤時間，死亡時間等并比較EL4 荷瘤小鼠和EL4-GFP-luc2 荷瘤小鼠致瘤性；分別在接種瘤細胞后第3d、7d、14d和21d 應用NightOWL LB

6、983 Ⅱ活體動物可見光成像系統(tǒng)對小鼠進行活體成像1 次，觀察腫瘤的生長、分布及轉移；解剖小鼠，取發(fā)光陽性組織器官進行體外發(fā)光檢測；流式檢測發(fā)光組織的CD3表達情況。
　　 結果：培養(yǎng)24h 后，用熒光倒置顯微鏡觀察，可見幾乎所有EL4-GFP-luc2細胞發(fā)出明亮的綠色熒光；熒光光度計檢測結果顯示，EL4-GFP-luc2細胞的熒光素酶活性﹥1×10 5RLU；皮下接種組和尾靜脈接種組小鼠成瘤率均為100[％]，皮下接種組小鼠

7、成瘤時間為14.6±2.0d，兩組小鼠生存時間分別為23.7±2.4d和22.8±2.7d，并且EL4 荷瘤小鼠和EL4-GFP-luc2 荷瘤小鼠致瘤性無明顯差異；活體生物發(fā)光系統(tǒng)觀察皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)隨腫瘤移植時間的推移，腫瘤生物發(fā)光信號增強并且移植瘤體積與熒光光子數(shù)成正相關(R2=0.9551)；尾靜脈移植小鼠分別在移植后第7d、14d和21d 出現(xiàn)淋巴結、骨髓、肝和脾轉移；組織器官體外發(fā)光檢測證實了活體體內腫瘤的分布及轉移；流式檢