銀耳不同生長(zhǎng)發(fā)育階段差異表達(dá)蛋白及其基因的研究.pdf

1、銀耳是一種典型的二形態(tài)藥食兩用真菌，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素及無(wú)機(jī)鹽，被譽(yù)為“菌中之冠”。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，是生理功能的執(zhí)行者，從蛋白質(zhì)水平入手克隆基因，再進(jìn)行基因功能的研究可以更加全面立體地闡明基因所起到的實(shí)際功能，進(jìn)而可以更好地理解生命活動(dòng)的發(fā)生機(jī)理及調(diào)控規(guī)律。本研究采用Tris-飽和酚法提取銀耳芽孢及菌絲總蛋白后，應(yīng)用2-DE及MALDI-TOF MS/MS技術(shù)找出并鑒定了銀耳芽孢及菌絲這兩個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的差異表達(dá)蛋白，

2、并根據(jù)其中2個(gè)差異表達(dá)蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆了其差異表達(dá)基因，為銀耳不同生長(zhǎng)發(fā)育階段調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果如下:
　　1、在液氮研磨的基礎(chǔ)上，采用超聲波與高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞破碎效果、Bradford法測(cè)定蛋白含量并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，比較了Tris-飽和酚法、TCA/丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結(jié)合TCA/丙酮沉淀法提取銀耳芽孢總蛋白的效果，結(jié)果表明高壓均質(zhì)的細(xì)胞破碎效果優(yōu)于超聲

3、波，三種方法所得到的蛋白含量分別為2.33 mg/mL、1.26 mg/mL及1.02 mg/mL，且Tris-飽和酚法所得電泳條帶亮度及清晰度均優(yōu)于其他兩種方法。進(jìn)而應(yīng)用Tris-飽和酚法提取銀耳菌絲總蛋白同樣取得了很好的效果，從而建立了銀耳芽孢及菌絲總蛋白的一種有效提取方法。
　　2、應(yīng)用Tris-飽和酚法提取的銀耳芽孢及菌絲總蛋白通過(guò)2-DE分析選取了53個(gè)差異蛋白點(diǎn)，將這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF MS/MS分析，