γ-分泌酶抑制劑對順鉑耐藥上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移能力的影響.pdf

1、目的:上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）為最常見的卵巢惡性腫瘤，不易早期診斷，復發(fā)及死亡率高。卵巢癌目前標準治療方法主要為腫瘤細胞減滅術及以鉑類為基礎的化療，但約70-80％的患者最終會出現(xiàn)化療耐藥，引起腫瘤的復發(fā)及轉移，為卵巢癌治療失敗及患者死亡的重要原因，故其5年生存率一直徘徊在30％左右。因此，探討化療耐藥腫瘤的侵襲轉移機制，尋找有效的干預靶點，為EOC患者延長生存期和改善預后的迫切需求。

2、
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)不僅參與胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷修復，在腫瘤的侵襲轉移過程中也發(fā)揮了重要作用。EMT是指特定的生理或病理情況下，上皮細胞丟失上皮表型的特性轉化為間質表型細胞過程。發(fā)生EMT的細胞極性丟失，細胞間粘附力下降，運動能力增強，細胞形態(tài)延伸，抗凋亡能力增強，從而促進腫瘤侵襲轉移。EMT與多種細胞因子、轉錄因子及信號通路相關。EMT過程伴隨

3、著Notch、Wnt、Hedgehog等多種信號通路的活化;轉錄因子Snail和Slug等表達上調;上皮表型標志物E-cadherin等表達下調，間質表型標志物vimentin等表達上調。此外，發(fā)生EMT的腫瘤細胞可獲得自我更新等干細胞樣特性，這可能與腫瘤細胞發(fā)生化療抵抗相關。
　　多年研究表明，Notch信號通路在多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中均異常表達，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。新近研究表明，Notch信號通路活化可誘導多種腫

4、瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤的轉移和復發(fā)。γ-分泌酶為激活Notch信號通路的核心環(huán)節(jié)，而成為腫瘤治療的研究熱點。本實驗通過體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3及其順鉑耐藥株SKOV3/DDP，檢測其Notch1 mRNA表達量的差異，并進一步研究γ分泌酶抑制劑DAPT作用于SKOV3/DDP細胞后，E-cadherin及vimentin的表達情況，以及其遷移及穿膜能力的改變。旨在從分子水平探討DAPT能否通過抑制Notch信號通路

5、，從而抑制化療耐藥EOC的侵襲轉移能力，為化療耐藥EOC的治療策略提供實驗依據(jù)。
　　方法:用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，飽和濕度5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3、及其順鉑耐藥株SKOV3/DDP。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。
　　1.倒置顯微鏡觀察SKOV3細胞及SKOV3/DDP細胞的形態(tài)并拍照。
　　2.實時熒光定量PCR(PT-PC)檢測SKOV3細胞及

6、SKOV3/DDP細胞Notch1 mRNA表達水平。
　　3.四甲基偶氮唑藍(MTT)法:對SKOV3/DDP細胞以不同濃度的DAPT(25，50，75μmol/L)作用不同時間(24h、48h、72h)，以加入DAPT的溶劑0.375％ DMSO為對照組。MTT法檢測DAPT對細胞生長的影響，篩選出藥物作用的最適濃度及時間。
　　4.蛋白印跡法(Westem blotting):檢測SKOV3細胞及不同濃度的DAPT(0

7、，25，50，75μmol/L)作用于SKOV3/DDP細胞48h后，上皮標記物E-cadherin和間質標記物vimentin的表達水平。
　　5.劃痕實驗:常規(guī)培養(yǎng)SKOV3/DDP細胞使其融合形成單細胞層，無血清培養(yǎng)基同步化24h后，按實驗分組加入不同干預（實驗組:50μmol/LDAPT;對照組:0.25％DMSO），在培養(yǎng)板底部中央呈“一”字形劃痕，分別于給藥后0h、24h后倒置顯微鏡(40×)下觀察照相，計算24h內劃

8、痕愈合的面積評估細胞的遷移能力。
　　6.Transwell實驗:以50μmol/L DAPT作用SKOV3/DDP細胞為實驗組，以加入0.25％DMSO為對照組，連續(xù)培養(yǎng)24小時后取出Transwell侵襲小室，用95％乙醇固定，經(jīng)結晶紫染色，在顯微鏡(200×)下拍照并計數(shù)移至微孔膜下層的細胞評估細胞的遷移和侵襲能力。
　　7.應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1.SKOV3細胞與SK

9、OV3/DDP細胞:倒置顯微鏡下觀察，SKOV3細胞呈橢圓形、圓形或立方形，呈鋪路石樣排列，胞間連接緊密，為典型上皮樣細胞形態(tài);SKOV3/DDP細胞呈長梭形，細胞排列較松散，胞間連接不緊密，呈間質細胞樣形態(tài);Western blotting檢測結果示:SKOV3/DDP細胞的E-cadherin表達量低于SKOV3細胞（0.054±0.012 VS0.718±0.125），而Vimentin表達量高于SKOV3細胞（3.232±0.2

10、67 VS0.517±0.059），差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;RT-PCR結果示SKOV3/DDP細胞Notch1 mRNA的表達量為SKOV3細胞的3.952倍。
　　2.MTT結果示，隨著DAPT濃度增加和作用時間的延長，SKOV3/DPP細胞的生長抑制率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。
　　3.Western blotting結果示不同濃度的DAPT（25、50、75μmol/L）作用于SKO

11、V3/DDP細胞48h后，其上皮標記物E-cadherin表達較對照組明顯增加（0.207±0.020、0.295±0.011、0.429±0.024 VS0.054±0.012）(P＜0.01)，且隨DAPT作用濃度增加而升高，各組間差異顯著(P＜0.01);間質標記物vimentin表達較對照組明顯降低(2.502±0.170、1.873±0.177、1.624±0.057VS3.232±0.266)(P＜0.01)，但50μmol

12、/L與75μmol/L濃度組表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4.以濃度為50μmol/L的DAPT作用于SKOV3/DDP細胞24h后，劃痕試驗結果:處理組的劃痕愈合面積顯著小于對照組（14.31±3.59 VS52.91±10.59）(P＜0.01);Transwell實驗結果示處理組穿膜細胞個數(shù)明顯少于對照組（遷移實驗13±2 VS37±2，侵襲實驗9±1 VS27±3），差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。