日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白在畢氏酵母菌的克隆表達及其免疫反應性研究.pdf

1、血吸蟲病(Schistosomiasis)是嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，也是我國當前防治的重點傳染病之一。至2005年，全國有疫情未控制縣(市、區(qū)，簡稱縣)105個，疫情回升縣38個，血吸蟲病人79.8萬，釘螺面積38.6億平方米，且每年都有急性血吸蟲病例發(fā)生，血吸蟲病防治形勢依然嚴峻，防治工作任重而道遠。 控制血吸蟲病關鍵之一就是要及時和準確地發(fā)現(xiàn)病人，因此血吸蟲病診斷在查病治病體系中始終處于中心位置。病原學檢查是血吸

2、蟲病確診的唯一手段，但其敏感性和依從性較低。免疫學診斷技術具有較高的敏感性和特異性，可彌補病原學檢查不足，因此已逐漸整合到我國血吸蟲病防治工作中。 目前常用的血吸蟲抗體檢測技術的敏感性多在90％以上，但其特異性尚待提高，如與健康者假陽性率多在3％～5％之間，與并殖吸蟲、華支睪吸蟲、旋毛蟲的交叉反應率分別在10％～17％、4％～10％和8％～13％之間。主要原因是血吸蟲與其它寄生蟲之間存在著相同或相似抗原表位。 免疫診斷技

3、術特異性的關鍵取決于抗原的純度。目前常用血吸蟲病診斷抗原多為蟲卵或成蟲粗制抗原，有成份復雜、交叉反應率偏高等缺陷。而成分抗原也存在制備過程復雜，抗原得量較少，似不具備推廣價值。隨著基因重組技術的快速發(fā)展和在血吸蟲病免疫診斷中的應用，有可能為改善免疫診斷方法提供新手段。例如，可進一步提高診斷方法的特異性，制備的重組抗原易于標準化，并進入工業(yè)化批量生產(chǎn)的程序。因此，篩選并克隆表達極具診斷價值潛能的新型重組抗原作為特異性診斷抗原，對血吸蟲病診

4、斷工作具有很大的現(xiàn)實意義。 日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白(SjcTrX)由106個氨基酸組成，分子量約為12kDa，在蟲體內分布廣，具有氧化還原調節(jié)功能和多種生物學活性，是血吸蟲存活過程中的一個非常重要的生理分子。已有研究表明曼氏血吸蟲Trx具有較好的免疫原性和免疫反應性，有可能成為理想的免疫診斷抗原。 原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中表達的蛋白缺乏翻譯后的修飾和糖基化，其抗原活性較低。而畢氏酵母表達系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的蛋白質真核表

5、達系統(tǒng)，既有原核生物生長快、操作簡單等特點，又有哺乳動物細胞表達系統(tǒng)翻譯后加工和修飾的功能，分泌表達產(chǎn)物無過度糖基化且易于純化，因此具有重要的潛在應用價值。 為探討sjcTrx重組抗原作為日本血吸蟲病特異性診斷抗原的可能性，本研究開展SjcTrx編碼基因在畢氏酵母菌克隆和表達工作，并進行了免疫反應性的研究。 首先，根據(jù)公布的日本血吸蟲菲律賓株Trx基因序列設計一對引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點和起始密碼子ATG，下

6、游引物引入XbaⅠ酶切位點。以日本血吸蟲大陸株成蟲總RNA為模板，經(jīng)反轉錄--聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增SjcTrx基因。雙酶切并純化的PCR產(chǎn)物與同樣雙酶切并純化的含AOX1啟動子pPICZαA質粒DNA片段用T4 DNA連接酶連接，構建重組質粒pPICZαA-SjcTrx，轉入至大腸桿菌Top10，獲得高拷貝重組質粒。經(jīng)限制性內切酶雙酶切、PCR擴增和核苷酸序列鑒定正確后，用BstXⅠ酶單切重組質粒pPICZαA-SjcTrx

7、使其線性化，并轉化至感受態(tài)X-33畢氏酵母菌。用含有100μg/mlZeocin的YPDS平板篩選集落，經(jīng)測序確認后用Pichia pastoris EasySelect<'TM>表達系統(tǒng)BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，用甲醇誘導AOX1啟動子表達產(chǎn)生可溶性重組SjcTrx蛋白。SDS-PAGE分析組SjcTrx蛋白，Ni<'2+>吸附組氨酸標記的親和層析法純化，Western blotting觀察重組SjcTrx蛋白的免疫反應性。研究結果顯示，S

8、jcTrx編碼基因RT-PCR擴增產(chǎn)物約335bp，分子量與預計大小一致。構建的pPICZαA-SjcTrx/TOP10 重組質粒DNA經(jīng)限制性內切酶雙酶切和PCR擴增，在瓊脂糖凝膠電泳中均觀察到相同大小基因片段，核苷酸序列測序證實SjcTrx基因序列與設計的序列完全一致，長度為318bp，開放閱讀框架編碼含有106個氨基酸，已登錄到GenBank (DQ401029)。SjcTrx與日本血吸蟲菲律賓株Trx和曼氏血吸蟲TrxDNA序列

9、同源性分別為98％(313/318)和70％(223/318)，推導的氨基酸序列同源性分別為96％(102/106)和64％(68/106)。重組表達載體pPICZαtA-SjcTrx/X-33經(jīng)限制性內切酶單酶切、PCR擴增和核苷酸序列測定均證實SjcTrx基因已整合于畢氏酵母菌染色體中。經(jīng)SDS-PAGE分析，在BMGY培養(yǎng)液中甲醇誘導可表達出SjcTrx重組蛋白，分子量約為14kDa，48～72h蛋白表達量最高。經(jīng)Ni<'2+>吸