pNL-hHGF-EGFP慢病毒載體的構建、鑒定及表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  構建含人肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因的慢病毒載體,檢測hHGF基因的mRNA和蛋白在293T細胞中的表達情況,為研究hHGF基因的功能奠定基礎。
  方法:
  1.選擇合適的酶切位點,將hHGF cDNA基因片段(包含有啟動子和多聚腺苷酸A尾)從pUC-SRα-HGF載體酶切獲取,平端連接入慢病毒載體pNL-EGFP,構建重組慢病毒載體pNL

2、-hHGF-EGFP。
  2.將pNL-hHGF-EGFP轉染293T細胞,應用RT-PCR、ELISA方法檢測hHGF基因在293T細胞中的表達。
  3.將pNL-hHGF-EGFP與輔助質粒pHELPER、pVSVG以一定比例共轉染293T細胞,收集48h、72h病毒上清,經超濾濃縮后,測定病毒滴度,獲得高滴度慢病毒顆粒。
  結果:
  1.hHGF cDNA基因片段正確的克隆到pNL-EGFP慢病毒載

3、體上,電泳結果和酶切鑒定均能得到與理論大小相符合的片段,測序結果與Genebank序列完全一致。
  2.pNL-hHGF-EGFP轉染293T細胞后綠色熒光蛋白有表達,轉染24后RT-PCR檢測到轉染的293T細胞中hHGF基因mRNA表達,轉染48h后細胞上清中HGF蛋白含量為52.72±13.09ng/ml。
  3.三質粒共轉染293T細胞成功獲得慢病毒,測得病毒的滴度為1.5×106TU/ml。
  結論:<

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