納米粒介導人arresten基因轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈內(nèi)膜增生的抑制作用.pdf

1、背景:對長段或多節(jié)段中小血管慢性阻塞而不適于血管腔內(nèi)干預的患者，采用血管旁路術(shù)行冠狀動脈或肢體動脈轉(zhuǎn)流手術(shù)，目前仍然是挽救患者生命和肢體功能的主要手段。自體靜脈是血管旁路移植物的金標準，與其他類型的移植物相比，自體靜脈最大的特質(zhì)就是靜脈血管術(shù)后對于動脈環(huán)境的適應(yīng)性改變，這種適應(yīng)性改變通常被稱為“靜脈動脈化”。自體靜脈移植物術(shù)后動脈化的能力是其他人造移植物無法替代的。從1950年開始自體靜脈被廣泛應(yīng)用于缺血性疾病患者的血管重建手術(shù)，但是2

2、0-50％的靜脈移植物由于其手術(shù)以后的重塑過程導致血栓形成、再狹窄等，最終導致血管移植手術(shù)失敗。一旦血管重建術(shù)后再狹窄形成，就需要再次進行血管移植術(shù)或血管內(nèi)支架置入術(shù)等血管重建手術(shù)，手術(shù)引起的血管損傷，日后仍會導致血管再狹窄形成。目前仍沒有有效的治療方法來減輕移植靜脈血管壁的過度增厚，移植血管再狹窄的機制及其防治措施一直是臨床研究的熱點。
　　從目前的研究結(jié)果來看，移植靜脈早期再狹窄與缺氧、手術(shù)過程損傷等原因?qū)е碌难軆?nèi)皮損傷部位

3、急性血栓形成有關(guān);移植靜脈中后期再狹窄與中膜血管平滑肌細胞、外膜成纖維細胞的遷移與增殖、細胞增生與凋亡失去平衡、新生內(nèi)膜過度增生密切相關(guān)。血管平滑肌細胞過度增殖并向內(nèi)膜遷移是新生內(nèi)膜增生的重要病理基礎(chǔ)，是各種因素導致血管重建術(shù)后血管再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，抑制血管平滑肌細胞過度增殖及遷移是防治靜脈移植術(shù)后再狹窄的有效策略。
　　移植靜脈內(nèi)膜增生的發(fā)生過程是多種細胞因子和血管活性物質(zhì)介導的局部血管重構(gòu)的過程，涉及到一系列復雜的病理過

4、程，目前臨床使用的藥物都未能有效降低再狹窄的發(fā)生率?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)是防治移植靜脈新生內(nèi)膜過度增生的重要方法，選擇適當?shù)陌谢蜻M行局部轉(zhuǎn)染表達，針對血管再狹窄不同時期病變的進程，抑制內(nèi)膜增生的病理過程。國內(nèi)外學者已經(jīng)作了許多這一方面的研究，但目前尚未找到一種滿意的移植血管基因轉(zhuǎn)移方法，實際應(yīng)用時如何選擇相應(yīng)的血管基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（選取高效低毒的載體、提高轉(zhuǎn)染率、減輕副作用等），可能是今后研究的方向之一。
　　納米基因載體是將DNA、RNA

5、等治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，在細胞攝取作用下進入細胞內(nèi)，實現(xiàn)目的基因持續(xù)穩(wěn)定的表達。可生物降解的PLGA（乳酸-乙醇酸共聚物）納米粒載藥系統(tǒng)因其具有緩釋作用而成為納米粒子研究中的熱點。但是由于治療基因多是高度親水的大分子物質(zhì)，將其包封于疏水性的PLGA納米粒中存在一定困難，而且DNA從疏水性的PLGA納米粒中的釋放過于緩慢，從而影響DNA的起效時間，因而有必要對PLGA進行結(jié)構(gòu)修飾以提高其親水性，以改善載基因納米粒的包封

6、率和釋放性能。
　　Arresten基因是2000年由Colorado等研究發(fā)現(xiàn)的一種基底膜來源的內(nèi)源性血管生成抑制因子，由230個氨基酸殘基組成，其分子量約為26kD，是Ⅳ型膠原α1鏈的羧基末端NC1結(jié)構(gòu)域多肽片段。研究證實，arresten抑制新血管形成及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移效果明顯，其活性為現(xiàn)今熱點研究中的Endostatin的3-10倍，因此，arresten被認為是繼Endostatin之后新的極具潛力的血管生長抑制因子。ar

7、resten在Ⅳ型膠原聚集、基底膜形成、調(diào)節(jié)細胞生物學行為方面發(fā)揮重要作用，能抑制內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞的增殖和遷移，誘導內(nèi)皮細胞的凋亡。
　　綜合既往關(guān)于血管移植術(shù)后再狹窄和基因治療及納米載體研究的理論成果和結(jié)論，我們提出一個新的關(guān)于血管移植術(shù)后再狹窄治療的假設(shè):把arresten基因治療和納米粒載體系統(tǒng)兩種方法聯(lián)合起來，利用經(jīng)過PEG修飾的PLGA納米粒子介導arresten基因局部轉(zhuǎn)染移植靜脈，增強基因耐核酸酶的能力，改善

8、載基因納米粒的包封率和釋放性能，延長納米粒在體內(nèi)血液循環(huán)的時間。課題根據(jù)這一個假設(shè)進行設(shè)計，擬明確納米粒介導arresten基因轉(zhuǎn)染對移植靜脈內(nèi)膜增生的影響，并研究其發(fā)揮作用的機制，從而為臨床提高血管重建術(shù)的中遠期療效提供治療思路。
　　目的:研究構(gòu)建arresten基因真核表達載體;以PEG-PLGA為載體材料，制備出生物可降解型載基因納米粒;建立兔自體靜脈移植模型，局部定位轉(zhuǎn)染arresten基因納米粒，通過移植靜脈病理圖像分

9、析、病理組織學觀察、免疫組化分析、熒光定量PCR等手段，探討納米粒介導人arresten基因局部轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈內(nèi)膜增生的作用及其可能的作用機制。
　　方法:
　　(1)設(shè)計arresten序列進行人工合成，根據(jù)構(gòu)建需求在5'端添加ATG起始密碼子，并添加增強表達的kazak序列GCCACC，3'端去除終止密碼子，共計708bp，并在上游引入HindⅢ酶切位點，下游引入BamHⅠ酶切位點。序列合成后裝載至pUC57中間載體，

10、并進行酶切及測序驗證。雙酶切pUC57-arresten和pEGFP-N1質(zhì)粒，在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應(yīng)。采用內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten。取純化的重組質(zhì)粒樣品，進行核苷酸序列測定，以確認目的基因序列是否正確。
　　(2)采用改良的納米粒沉淀法制備包封型載arresten基因PEG-PLGA納米粒。稱取20mgPEG-PLGA，接著將其溶解在1mlDMSO的溶液

11、中（含200“g的DNA），然后把此溶液在微量注射泵的配合下滴入20ml的F127(0.5％，w/v)的乳化劑中以制備載基因的納米粒混懸液。最后，混懸液經(jīng)低溫高速的離心作用后，收集其離心上清液應(yīng)用PicoGreen熒光分光光度法測定載基因納米粒的包封率及理化性質(zhì)。
　　(3)以新西蘭大白兔為研究對象，動物隨機分為3組:空白組、對照組、arresten組，每組10只。采用游離的頸外靜脈間位移植至頸總動脈的方法建立兔自體靜脈移植模型。

12、在行血管吻合術(shù)前，將移植段血管置于納米粒介導的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten溶液中浸泡，轉(zhuǎn)染移植靜脈。術(shù)后1周及術(shù)后4周分別應(yīng)用彩超觀察靜脈橋通暢情況。手術(shù)4周后取出移植靜脈，常規(guī)行HE及Masson染色，運用計算機圖象分析技術(shù)來檢測兔移植靜脈的內(nèi)膜與中膜的厚度;采用免疫組化的方法來檢測金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、平滑肌細胞肌動蛋白(α-SMA)、細胞增殖核抗原(PCNA)的陽性表達情

13、況，熒光定量PCR方法檢測移植靜脈中arresten基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:
　　(1)重組質(zhì)粒序列比對分析顯示，插入到表達載體的目的基因的序列與人arresten基因片段序列完全一致，目的基因序列正確，證明arresten基因準確的克隆至表達載體中，試驗成功地構(gòu)建出arresten基因真核表達載體pEGFP-N1-arresten。
　　(2)試驗順利制備了一種包封型的載arresten基因的PEG-PLG

14、A納米粒。這種納米粒呈均勻的球形，納米粒的粒徑分布不寬，arresten基因能夠高效的包封于PEG-PLGA納米粒中（包封率96.64±0.202％），DNA的結(jié)構(gòu)得到保持。
　　(3)成功建立兔自體靜脈移植模型30只，手術(shù)過程無死亡，1只術(shù)后20天死于消化道感染，余均健康存活。29只存活動物手術(shù)后無活動功能障礙，術(shù)后精神、飲食、活動正常，切口愈合好，無紅腫、滲出或膿腫形成。取材前檢查存活動物移植靜脈27例通暢，靜脈搏動良好，血管

15、與周圍組織有粘連，未見移植靜脈破裂，無深部感染，1例移植靜脈重度擴張導致血管瘤形成，2例閉塞。術(shù)后第1、4周分別觀察到1只動物移植靜脈閉塞。切取標本行熒光定量PCR，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten轉(zhuǎn)染的血管組織中有目的基因mRNA的表達;通過病理計算機圖象技術(shù)分析可知，轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的內(nèi)膜厚度以及中膜厚度均分別比對照組、空白組小，轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的內(nèi)膜增生的程度分別比空白組、對照組輕(P＜0

16、.05)。血管平滑細胞是增生內(nèi)膜中主要的細胞;轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的移植靜脈的PCNA陽性細胞數(shù)量與表達指數(shù)，均比空白組、對照組更小(P＜0.05);轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的MMP-2及MMP-9表達均少于空白組及對照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　采用改良的納米粒沉淀法成功制備了包封型載pEGFP-N1-Arresten基因PEG-PLGA納米粒，質(zhì)粒DNA可以行之有效地包封在PEG-

17、PLGA納米粒里面（研究結(jié)果顯示，這種包封率超過95％），也較好地保持了DNA結(jié)構(gòu)的完整性。采用游離的頸外靜脈間位移植至頸總動脈的方法可以成功建立兔自體靜脈移植模型，具有成功率高、損傷小、圍手術(shù)期死亡率低等優(yōu)點。采用移植靜脈浸泡于基因納米粒中的方法可以成功將目的基因?qū)胍浦察o脈細胞中，PEG-PLGA納米?？梢越閷Ь植慷ㄎ晦D(zhuǎn)染人arresten基因，從而有效抑制兔移植靜脈內(nèi)膜的增生，人arresten基因抑制兔移植靜脈內(nèi)膜的增生的作用機