阿爾茨海默病中鈣依賴性蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞基Ⅱα磷酸化及其對(duì)PKA-CREB通路的影響.pdf

1、第一部分體外鈣離子孵育對(duì)C57BL/6 小鼠腦神經(jīng)元及PC12細(xì)胞內(nèi)PKA-RⅡα分子量表達(dá)的影響
　　 目的:探討cAMP 依賴性蛋白激酶（PKA)調(diào)節(jié)亞基Ⅱα（RⅡα）在C57BL/6 小鼠腦神經(jīng)元體外鈣離子孵育及加入不同干擾因素條件下的表達(dá)變化。
　　 方法:取8只C57BL/6 小鼠前腦組織勻漿裂解隨機(jī)分為8組，分別應(yīng)用以下條件予以處理：勻漿后不孵育作為對(duì)照1，不作處理僅30℃孵育10min 作為對(duì)照2，應(yīng)用2.

2、5mmol/LCaCl2 孵育，CaCl2 孵育前加入鈣離子螯合劑EDTA，CaCl2 孵育后加入EDTA再次孵育，CaCl2 孵育后加入堿性磷酸酶再次孵育，CaCl2 孵育前應(yīng)用外源性PKA 綁定蛋白Ht31 孵育，CaCl2 孵育前應(yīng)用無(wú)活性外源性PKA 綁定蛋白Ht31P 孵育；同時(shí)將大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12 cell）隨機(jī)分為8組，裂解后與前述做相同處理。應(yīng)用Western blot 法檢測(cè)腦組織及細(xì)胞內(nèi)RⅡα的表達(dá)情

3、況。
　　 結(jié)果：小鼠前腦組織及PC12細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，對(duì)照組1和2 內(nèi)RⅡα表觀分子量為51kDa；與CaCl2 孵育后，RⅡα表觀分子量為53kDa；若在CaCl2 孵育前加入EDTA，則RⅡα分子量為51kDa；CaCl2 孵育后加入EDTA 則其分子量為53kDa；CaCl2 孵育后加入堿性磷酸酶再次孵育，RⅡα分子量為51kDa；CaCl2 孵育前加入Ht31或Ht31P，RⅡα分子量皆為53kDa。
　　 結(jié)

4、論:RⅡα的分子量升高變化與Ca2+有關(guān)，且能被磷酸酶逆轉(zhuǎn)，與RⅡα的AKAP結(jié)合活性無(wú)關(guān)。
　　 第二部分 PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載對(duì)PKA 調(diào)節(jié)亞基 RⅡα表達(dá)的影響
　　 目的：探討細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)下PKA 各亞基的表達(dá)變化。
　　 方法：分別應(yīng)用Aβ1-42 寡聚體及KCl 造成PC12細(xì)胞內(nèi)鈣超載。采用5μmol/L 及10μmol/L的Aβ1-4237℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞30min，1h，

5、2h，4h，12h，采用50mmol/L 及100mmol/L的KCl37℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞5min，10min，20min，30min，60min。MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性，Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RⅡα亞基的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Aβ1-42 寡聚體及KCl 孵育PC12細(xì)胞后，皆對(duì)PC12細(xì)胞活性造成不同程度影響，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸下降。Western blot 檢測(cè)孵育后PKA 調(diào)節(jié)亞基R

6、Ⅱα先出現(xiàn)蛋白分子量的升高現(xiàn)象，與第一部分結(jié)果相似，同時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RⅡ分子量回到正常水平。
　　 結(jié)論：Aβ1-42 寡聚體及KCl 對(duì)PC12細(xì)胞有明顯毒性作用，并可致RⅡα蛋白分子量升高，其后則恢復(fù)到正常水平。
　　 第三部分不同激酶抑制劑對(duì)RⅡα分子量變化的影響
　　 目的：研究不同激酶抑制劑對(duì)RⅡα分子量變化的影響，找出使得RⅡα分子量變化的具體激酶。
　　 方法：以5μmol/L的A

7、β1-42 寡聚體37℃條件下孵育PC12細(xì)胞2h 及100mmol/L的KCl37℃條件下孵育PC12細(xì)胞20min 造成RⅡα分子量變化模型，以未處理的PC12細(xì)胞為空白對(duì)照，分別同時(shí)應(yīng)用PKA 抑制劑H89、PKC 抑制劑Staurosporine、CaM抑制劑W-7，應(yīng)用Western blot 檢測(cè)各組RⅡα分子量表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：5μmol/L的Aβ1-42 寡聚體處理PC12細(xì)胞2h 及100mmol/L的K

8、Cl 處理PC12細(xì)胞20min后，RⅡα分子量由51kDa 上升為53kDa，同時(shí)分別應(yīng)用H89、Staurosporine，W-7后，僅W-7 能逆轉(zhuǎn)這種分子量表達(dá)的變化。
　　 結(jié)論 RⅡα分子量的變化為CaMK 所致的磷酸化，這種磷酸化與PKA或PKC 無(wú)明顯關(guān)系。
　　 第四部分Aβ1-42 對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)PKA 活性的影響
　　 目的：研究Aβ1-42 孵育對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)PKA 活性的影響方法研究

9、Aβ1-42寡聚體不同孵育時(shí)間下對(duì)PKA活性的影響，PC12細(xì)胞隨機(jī)分組如下：5μmol/L的Aβ1-42于37℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞0min、30min、1h、2h、4h、12h，；研究不同干預(yù)條件下鈣超載對(duì)PKA活性的影響，PC12細(xì)胞隨機(jī)分組如下：對(duì)照組：不作任何干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組：5μmol/L的Aβ1-42寡聚體于37℃孵育2h，10μmol/L的W-7處理1h，10μmol/L的W-7預(yù)處理1h+5μmol/L的Aβ1-42

10、寡聚體孵育2h，50μmol/L的Ht31+5μmol/L的Aβ1-42寡聚體孵育2h，50μmol/L的Ht31P+5μmol/L的Aβ1-42寡聚體孵育2h。孵育后采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA磷酸化底物表達(dá)水平，以證實(shí)PKA活性變化。
　　 結(jié)果：Aβ1-42 寡聚體處理PC12細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKA 底物表達(dá)先升高后降低，單用W-7 對(duì)磷酸化PKA 底物表達(dá)無(wú)明顯影響，Aβ1-42 寡聚體干預(yù)前W-7的加

11、入抑制了磷酸化PKA 底物表達(dá)的升高，Ht31 及Ht31P的加入均對(duì)磷酸化PKA 底物表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：Aβ1-42 寡聚體所致細(xì)胞內(nèi)鈣超載顯著影響了PKA的活性，W-7 抑制PKA 活性升高可能與其抑制了RⅡα磷酸化有關(guān)，PKA的活性變化與其AKAP 結(jié)合位點(diǎn)無(wú)關(guān)。
　　 第五部分鈣離子超載對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)CREB 活性的影響
　　 目的研究PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)下，CREB 活性的變化。<

12、br>　　 方法：將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不作任何干預(yù)，Aβ1-42 實(shí)驗(yàn)組分組如下：W-7組、Aβ1-42組、W-7+Aβ1-42組，Aβ1-42+H89組、Aβ1-42+staurosporine組；KCl 實(shí)驗(yàn)組分組如下：W-7組、KCl組、W-7+KCl組，KCl+H89組、KCl+staurosporine組。孵育后采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化CREB（pCREB）水平，以證實(shí)CREB活

13、性變化。
　　 結(jié)果：Aβ1-42 及KCl 處理PC12細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)pCREB表達(dá)增加，單用W-7 對(duì)pCREB表達(dá)無(wú)明顯影響，Aβ1-42 及KCl 干預(yù)前W-7的加入抑制了pCREB表達(dá)的升高，H89的加入顯著減少了pCREB的表達(dá)，staurosporine的加入對(duì)pCREB表達(dá)變化無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：Aβ1-42 及KCl 所致細(xì)胞內(nèi)鈣超載顯著影響了CREB的激活，W-7 可抑制CREB的激活，可能與其抑