骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增加大鼠黃疸肝臟選擇性門(mén)靜脈結(jié)扎后肝功能儲(chǔ)備的研究.pdf

1、第一部分，目的:梗阻性黃疸(OJ,Obstructivejaundice),是肝膽胰外科常見(jiàn)的臨床病理狀態(tài)之一。為了更好地了解其發(fā)病機(jī)制,學(xué)者已經(jīng)嘗試建立了多種大鼠梗阻性黃疸引流模型,但膽管堵塞、腸道返流等并發(fā)癥仍常見(jiàn)。本研究利用顯微外科技術(shù),建立了一個(gè)穩(wěn)定的大鼠梗阻性黃疸內(nèi)引流模型。
　　方法:經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究,我們制定了規(guī)范的手術(shù)程序。所有的操作均在顯微鏡下進(jìn)行。第一次開(kāi)腹建立黃疸模型,往胰腺端膽總管插入引流管約3mm長(zhǎng),腹壁固

2、定;二次開(kāi)腹時(shí)引流管放入肝臟側(cè)擴(kuò)張的膽管,并確認(rèn)結(jié)扎固定牢固。測(cè)量大鼠肝重、體重,生化檢測(cè),超聲檢查,超聲彈性成像,病理檢查,檢驗(yàn)引流后肝切除耐受能力等,評(píng)估新型模型的穩(wěn)定性。
　　結(jié)果:大鼠黃疸7天內(nèi)引流后,體重開(kāi)始上升,血糖和白蛋白恢復(fù)到正常水平,營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn);未見(jiàn)后期膽管返流、堵塞等并發(fā)癥。在術(shù)后第一天,少數(shù)大鼠可見(jiàn)一過(guò)性的淀粉酶和脂肪酶升高,但很快下降到正常水平。膽管引流后,各項(xiàng)生化指標(biāo),肝重體重比,超聲彈性值,肝臟病

3、理改變均可恢復(fù)到正常水平。膽道引流七天后,有六只大鼠行85％肝切除,全部存活;術(shù)后肝再生好。
　　結(jié)論:采用顯微外科技術(shù),我們建立了一個(gè)新型穩(wěn)定的大鼠梗阻性黃疸內(nèi)引流模型,特別適合于需要做長(zhǎng)期膽道引流的研究。
　　第二部分，目的:肝門(mén)部膽管癌(Hilarcholangiocarcinoma,HCCA)侵襲性強(qiáng)。為達(dá)到無(wú)瘤切緣,常要進(jìn)行大范圍肝切除,但帶來(lái)嚴(yán)重的近期并發(fā)癥是殘留肝臟的功能衰竭。近年來(lái),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC

4、s,bonemarrowderivedmesenchymalstemcells)被用于肝病臨床治療和基礎(chǔ)研究。本研究旨在探析選擇性膽管引流(SBD,Selectivebiliarydrainage)聯(lián)合選擇性門(mén)靜脈結(jié)扎(SPVL,SelectivePortalveinligation),附加BMSCs治療后,能否更快更多的增加黃疸肝臟的肝功能儲(chǔ)備。
　　方法:全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠原代BMSCs。流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞表型;經(jīng)不同

5、方式誘導(dǎo),茜素紅染色檢驗(yàn)成骨分化能力,油紅O染色檢驗(yàn)成脂能力。建立黃疸模型后,動(dòng)物被隨機(jī)分為三組,分別為SBD組,SBD+SPVL組和SBD+SPVL+BMSCs干預(yù)組。每組分三個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),分別為干預(yù)后第1、3、7天。觀察比較三組之間肝重體重比、脾重體重比、99mTc-GSA放射性計(jì)數(shù)、ICG清除率測(cè)試、血清生化指標(biāo)的差異。Westernblot法檢測(cè)肝組織中緊密連接蛋白Occludin表達(dá);ELISA法檢測(cè)IL-1β在肝臟的表達(dá);免

6、疫組織化學(xué)法觀察增生肝臟Ki-67表達(dá)。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)雄性大鼠原代BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs表達(dá)CD90,陽(yáng)性率為93.28%;細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo),具備成骨和成脂分化能力。大鼠OJ14天后,超聲楊氏彈性模量值較OJ7天時(shí)顯著升高,此時(shí)肝臟耐受70%肝切除能力差,所以選擇,建立黃疸14天大鼠模型,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。SPVL后,BMSCs門(mén)靜脈輸入可以加快非結(jié)扎側(cè)肝臟更快的生長(zhǎng),并且結(jié)扎側(cè)肝臟的萎

7、縮更加明顯。CM-Dil標(biāo)記的BMSCs,在術(shù)后24小時(shí),聚集于大血管周?chē)?術(shù)后7天,隨著細(xì)胞的分裂遷移,在肝臟實(shí)質(zhì)呈彌漫分布,同時(shí)CM-Dil膜標(biāo)記隨細(xì)胞分裂減弱。干預(yù)后第1、3天,SBD+SPVL+BMSCs組下肝葉的放射性計(jì)數(shù)顯著高于SBD+SPVL組,分別為192.3±15.8vs.158.7±23.1和274.2±10.2vs.225.3±29.8,p<0.05;第7天兩組之間差異不顯著。和SBD+SPVL組相比,在干預(yù)后第3

8、、7天,SBD+SPVL+BMSCs組的血清TBIL和ALP值降得更快更低。SBD+SPVL+BMSCs組增生側(cè)肝臟組織IL-1β濃度低于其余兩組,在第1、3天表現(xiàn)的更加明顯。SBD+SPVL+BMSCs組增生肝臟Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在干預(yù)后迅速上升,第三天時(shí)占到22±5%。Occludin蛋白的表達(dá)在第三天時(shí)明顯升高,以SBD+SPVL+BMSCs組的升高最為明顯,在干預(yù)后第7天時(shí)仍維持在高水平。
　　結(jié)論:選擇性膽道引流聯(lián)合非