新型制備型電色譜裝置及其在極性小分子物質分離中的應用.pdf

1、隨著生物工程上游技術的迅猛發(fā)展,采用分離技術集成化的研究思路開發(fā)新型生物分離技術日漸引起學術界重視。將電泳與色譜分離技術進行集成,即在色譜分離過程中引入電場以提高色譜的分離度或分離速度是近年來國內外液相色譜技術的一個重要發(fā)展方向。目前,國內外有關制備型電色譜系統(tǒng)的研究工作只有少數(shù)課題組進行,這些研究都以蛋白質和核酸等生物大分子為分離對象,使用的固定相主要是分離大分子常用的排阻凝膠、離子交換凝膠和羥基磷灰石等介質。而在生物活性物質中,除了

2、蛋白質等生物大分子外,越來越多的極性小分子活性物質被發(fā)現(xiàn),例如,多肽、多酚、寡核苷酸和水溶性抗生素等。因為極性強,多為水溶性,作為藥品具有良好的生物相容性,但卻給分離工程師帶來難題。目前較成熟的制備技術,例如萃取技術和RP-HPLC(反相高效液相色譜)技術在非極性或弱極性小分子化合物的分離中有良好表現(xiàn),并且易于放大,但對強極性小分子物質的分離效果很差(例如頭孢菌素C和小分子寡核苷酸)。由于大部分強親水性物質都具有可解離基團,可以用毛細管

3、電泳或電色譜技術進行高效率的分離,但這些方法難以放大,不能制備微克級以上的樣品。因此,開發(fā)用來分離極性小分子物質的制備型電色譜技術可以為這類物質的分離純化提供新的制備手段,具有重要的實際意義。本課題在這樣的背景下,首次提出并設計了一套適合分離極性或弱極性小分子物質的制備型電色譜裝置,建立了各種適合分離或濃縮小分子物質的制備型電色譜技術,并對各種影響因素和分離機理進行了較全面的研究,揭示了通電對色譜分離過程的各種影響。
　　 以柱

4、色譜(40 cm×0.6 cm I.D.,40 cm×1.2 cm I.D.,40 cm×2.0 cmI.D.)為基礎設計并構建了制備型電色譜裝置,基本解決了電色譜技術放大引起的主要問題,即電解氣體進柱和焦耳熱累積的問題,確定了裝置的結構和實驗操作流程。與文獻報道的裝置類似,在色譜柱兩端各連接一個電極室以放置電極溶液和電極；但柱與電極室的連接方式及相對位置與文獻報道的不同。文獻報道的較成熟的裝置都在電極室和柱連接處用排阻膜或凝膠條分隔,

5、電極室的緩沖液和色譜柱的緩沖液分開。這樣,用膜或凝膠條可以很好地阻擋電解氣體進入色譜柱,同時電極緩沖液與外界循環(huán)又可以不斷帶走氣體。由于以大分子樣品為分離對象,樣品不會穿過膜或凝膠條進入電極緩沖液而造成損失。顯然,這些報道的裝置不適合可以自由出入排阻膜或凝膠條的小分子物質的分離。本課題的電極室均設計為敞口,將制備型色譜柱的出口電極室改成內徑約5 mm的T型三通管,放置在色譜柱側下方,與柱的支管相連。經過改進的裝置可以隨時排走電解產生的氣

6、泡,不再需要膜或凝膠進行分隔。色譜流出液經過T型三通管電極室后全部進入在線檢測器,不必擔心小分子樣品的泄漏。在冷卻系統(tǒng)中,除了用文獻報道的色譜柱夾套冷卻和進柱緩沖液槽冷卻外,還對出口T型電極室和連接管道等焦耳熱聚集部位進行了全方位的冷卻,確?？梢允┘虞^高電場(60～120 V/cm)(報道的制備型電色譜多用20～50 V/cm的低電場),分離過程穩(wěn)定。
　　 在本論文的主體部分,分別論述了以常用于分離小分子物質的非極性大孔吸附樹

7、脂、可以與陰離子物質構成離子排斥色譜的陽離子交換凝膠和具有多孔結構的排阻凝膠為固定相,用設計的制備型電色譜裝置分離幾種小分子極性物質,包括茶多酚、單核苷酸和水溶性頭孢菌素的研究結果。
　　 在裝有聚苯乙烯型非極性DIAION HP20樹脂的色譜柱上加反向電場(色譜柱入口加負極,出口加正極),可以從含有咖啡因的茶葉粗提物中部分分離茶多酚單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)。研究表明,色譜的主要影響

8、因素--固定相顆粒度、色譜流速和緩沖液中乙醇濃度,電泳的主要影響因素--緩沖液pH值等對樣品的保留時間都有明顯影響,證明該分離系統(tǒng)實現(xiàn)了電泳與非極性吸附色譜的疊加。在分離過程中,電泳、電滲和色譜都對分離有一定作用。在通電過程中,電場的存在還通過影響樣品在DIAION HP20樹脂顆粒內的傳質,影響樣品的非極性吸附色譜行為。由于實驗中使用的樹脂顆粒內孔徑較小(<30 nm),不足以引起顆粒內液體的電滲流動,導致帶有樣品的液體不易進入樹脂顆

9、粒內,傳質減慢。尤其是EGCG和ECG,因為樣品分子內的非極性基團的分布不對稱,色譜保留時間受電場影響更明顯。通過增大柱內徑,保持柱長不變的方式對電色譜柱進行了放大,結果施加相同的電場,可有效減少放大后的焦耳熱。放大后電泳仍然可與色譜作用疊加,但由于色譜柱的高徑比減小,損失了部分柱效,降低了分離效果。
　　 在填充弱酸性陽離子交換葡聚糖凝膠的離子排斥色譜柱上加反向電場(色譜柱入口加負極,出口加正極),凝膠上的羧酸基團可以被正極電

10、解產生的氫離子質子化,而且隨著通電時間的延長,凝膠的質子化程度提高,結果茶多酚(EGCG和ECG)與咖啡因的分離度增加,直到被完全分離。本課題首次研究了在離子排斥色譜柱上施加電場的分離,結果表明出口電極的電解反應修飾了固定相,減弱了樣品與固定相之間的離子排斥力,從而改善了樣品的色譜行為,是電場影響分離的主要因為。目前關于制備型電色譜的研究還未見涉及該原理,該法可以為類似的多酚或弱酸物質的分離純化提供參考。與在吸附色譜柱上通電分離茶多酚的

11、情況相比,此時電場的作用機理截然不同,體現(xiàn)了電場影響樣品色譜行為的不同方面。
　　 用分離生物大分子常用的排阻凝膠為固定相,通電分離親水性小分子--單核苷酸混合物和頭孢菌素混合物的研究,與前兩種分離茶多酚的方法不同,這里使用的排阻凝膠不與或微弱地與樣品發(fā)生吸附作用,所有樣品在不加電場時的保留時間相同,絲毫不能被分離。排阻凝膠的主要作用是作為電泳填充介質,防止樣品返混,并實現(xiàn)在線檢測與收集。通電后,樣品可以按照帶電量差異被分離,因

12、此該系統(tǒng)也可以看作制備型電泳系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),凝膠內孔徑越大,電泳分離效果越好。用恒組分緩沖液分離單核苷酸混合物時,根據(jù)電泳方向與液體流動方向一致還是相反,可以減小或延長樣品的保留,并根據(jù)帶電量分離樣品。在此基礎上,結合pH梯度緩沖液建立了等電聚焦電泳法,根據(jù)兩性頭孢菌素的等電點分離并濃縮了4種頭孢菌素分子,分離時間比離子交換色譜法短,樣品峰集中,緩沖液的輕微變化也不影響分離效果。等電聚焦電泳法用低濃度的乙酸和氨水溶液(0.01 mol/

13、L)制作pH梯度,價格便宜,配制方便,不僅可以用于結構相似的小分子物質的細分和精制,還可以用于極性小分子物質的濃縮。
　　 綜上所述,本課題主要針對極性小分子物質的分離建立了制備型電色譜裝置及4種在色譜柱上施加電場的分離方法,主要使用水溶液分離極性或弱極性小分子物質,并且都用水溶解樣品上樣。4種施加電場的方法的分離機理各不相同,但都體現(xiàn)了電場提高樣品分離度和洗脫濃度的優(yōu)點。建立的各種方法適合分離可溶于水的極性小分子物質,可以與常