海島棉GbRvd基因抗黃萎病機(jī)制研究.pdf

1、棉花是重要的纖維作物和經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)對(duì)全球經(jīng)濟(jì)有著巨大的影響。棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌引起的維管束病害，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，是棉花生產(chǎn)上的主要病害之一。長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐證明，防治棉花黃萎病的經(jīng)濟(jì)高效措施是選育和種植抗病品種。目前，傳統(tǒng)育種已無(wú)法滿足抗黃萎病品種的生產(chǎn)需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，為培育和改良黃萎病抗性新品種提供了一條新的途徑。利用基因工程進(jìn)行棉花抗病育種的前提條件是挖掘抗病基因并解析其抗性機(jī)制。實(shí)踐表明，陸

2、地棉中缺少抗黃萎病資源，而海島棉對(duì)黃萎病表現(xiàn)高抗甚至免疫。因此，本研究以課題組前期構(gòu)建的黃萎病誘導(dǎo)下的海島棉（Gossypium barbadense）Pima90-53全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行了抗黃萎病基因的挖掘，篩選并克隆了一個(gè)編碼CC-NBS-LRR(coiled-coil nucleotide-binding-site leucine-rich-repeat)類(lèi)型的基因，并初步分析表明該基因與棉花抗黃萎病相關(guān)，命名為GbRv

3、d（RVd=Resistance to Verticillium dahliae）。
　　為進(jìn)一步研究GbRvd抗病功能與機(jī)制，本研究對(duì)GbRvd進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，亞細(xì)胞定位，利用轉(zhuǎn)基因和組培技術(shù)將該基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草進(jìn)行超表達(dá)，同時(shí)利用VIGS技術(shù)對(duì)GbRvd進(jìn)行了沉默，分析基因超表達(dá)和沉默后對(duì)黃萎病的抗性變化，從組織結(jié)構(gòu)、生理生化等方面對(duì)該基因的抗病機(jī)制進(jìn)行了初步探索，獲得的主要研究結(jié)果包括:
　　1.利用生物

4、信息學(xué)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)GbRvd進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與觀察。ProtComp軟件預(yù)測(cè)GbRvd為胞外（分泌）蛋白;GbRvd的跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其包含3個(gè)跨膜域。GbRvd與GFP融合表達(dá)結(jié)果顯示的熒光信號(hào)主要分布于煙草表皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。這些結(jié)果表明細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)是GbRvd分布的主要位置。
　　2.將GbRvd基因構(gòu)建真核超表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合株系。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草

5、和擬南芥株系進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃萎病的抗性顯著提高。
　　3.利用VIGS技術(shù)沉默海島棉Pima90-53 GbRvd基因，沉默后的植株對(duì)黃萎病抗性顯著降低。黃萎病菌莖稈分離培養(yǎng)結(jié)果表明，GbRvd的沉默使黃萎病菌在植株莖稈中的擴(kuò)展速度加快;PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GbRvd沉默后植株莖稈中黃萎病菌菌量明顯增加。
　　4.沉默GbRvd能夠?qū)е轮仓昴举|(zhì)素、酚類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物含量顯著降低;SA、NO和H2O2的含