外源性T-bet基因轉入對小鼠肺癌細胞株Lewis生物學作用的影響.pdf

1、目的:
　　 以Lewis細胞株為靶向,體外觀察轉入外源T-bet基因對腫瘤細胞生物學特性和IFN-γ表達的影響,研究轉錄因子T-bet在抗腫瘤免疫中的作用；體內分析T-bet質粒(pIRES2-mT-bet—EGFP)對Lewis細胞小鼠皮下移植瘤發(fā)生發(fā)展的影響,探討應用T-bet改變腫瘤微環(huán)境、改善腫瘤機體免疫平衡狀態(tài)的可能性。
　　 方法:
　　 (1)構建plRES2-mT-bet-EGFP載體,應用脂質

2、體轉染的方法[質粒(μg):脂質體(1μl)=1:2]轉染Lewis細胞,PCR檢測轉染前后T-bet,IFN-γ的mRNA表達水平；流式細胞術檢測EGFP；ELISA檢測分泌的IFN-γ。以PIRES-eGFP質粒作為對照。
　　 (2)將1.5×106 Lewis肺癌細胞接種于小鼠右肩部皮下,制備皮下轉移瘤小鼠模型；分三組分別瘤內注射PIRES—eGFP／mT-bet、PIRES-eGFP質粒和PBS。
　　 (3)

3、觀察各組小鼠存活時間,腫瘤體積的變化；HE染色觀察腫瘤組織的病理改變；Western-Blot檢測腫瘤組織T—bet的表達,QRT-PCR檢測腫瘤組織T-bet和IFN-γ的mRNA水平。
　　 (4)觀察局部引流淋巴結的轉移情況,QRT-PCR檢測引流淋巴結T-bet和IFN-γ的mRNA的水平。
　　 (5)QRT-PCR檢測脾臟T-bet和IFN-γ的mRNA。
　　 結果:
　　 (1)用脂質體成

4、功將T-bet基因轉染Lewis細胞,通過對轉染前后細胞的研究表明,與對照組相比,T-bet和IFN-γ mRNA及蛋白的表達水平均明顯升高。
　　 (2)建立了肺癌的皮下轉移瘤小鼠模型,小鼠皮下移植瘤的發(fā)病率為100％,發(fā)病時間在Lewis細胞注射后6～7天；
　　 (3)瘤內注射pIRES2-mT-bet-EGFP后發(fā)現(xiàn),pIRES2-mT-bet-EGFP干預組小鼠腫瘤生長明顯變緩,存活期延長。Western-bl

5、ot檢測結果顯示,腫瘤組織T-bet蛋白表達顯著高于對照組；QRT-PCR結果顯示,腫瘤組織T-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趨勢,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HE染色組織病理觀察可見mT-bet干預組小鼠局部組織淋巴細胞大量浸潤。
　　 (4)腫瘤局部注射pIRES2-mT-bet-EGFP明顯延緩腫瘤局部引流淋巴結的轉移,QRT-PCR結果顯示,與對照組相比較,T-bet質粒干預組發(fā)生轉移的淋巴結T

6、-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趨勢(P<0.05),而脾臟T-bet和IFN-γ的mRNA水平表達沒有影響(P>0.05)。
　　 結論:
　　 T-bet基因轉染肺癌細胞株(Lewis細胞)可以明顯改善IFN-γ的表達。T-bet質粒局部注射可延緩小鼠肺癌Lewis皮下移植瘤的生長,延長小鼠的存活期,增強對已發(fā)腫瘤的生長限制作用,并且可以延緩腫瘤局部引流淋巴結的轉移,為基因介入的腫瘤生物治療奠定了基礎,為T-