納米雄黃制備及誘導U937腫瘤細胞凋亡機制研究.pdf

1、砷劑在治療血液腫瘤方面已取得了令人矚目的成績，尤其是近年來對急性早幼粒細胞白血病(APL)的治療已得到世界的公認，目前用于治療APL的砷化合物主要是雄黃和As2O3。本課題組近年來開發(fā)的復方黃黛片對急性早幼粒細胞白血病的完全緩解率達98.6％。其中君藥雄黃為硫化物類礦物雄黃族雄黃，主要成分為四硫化四砷，難溶于水，在胃腸道僅極少部分被吸收。隨著納米技術在中醫(yī)藥學中的應用，已有研究證明納米技術可以改變雄黃的理化性質、增加其水溶性，從而達到減

2、毒增效的用藥目的。為了進一步完善納米級雄黃的制備工藝，提高其生物利用度，本文對納米雄黃粉體(nanoparticlerealgarpowders，NRP)的制備工藝、分析方法及其誘導細胞凋亡的機制進行了較為系統(tǒng)的研究。 主要對納米雄黃粉體的制備工藝進行了優(yōu)化，建立了納米雄黃粉體的粒度分析研究方法，并對納米雄黃粉體在小鼠體內(nèi)的藥動學進行了初步研究。同時本文也深入研究了PI3-K/Akt和SIRT1/p53途徑在納米雄黃粉體誘導U9

3、37細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。 在對納米級雄黃制備工藝進行優(yōu)化研究的實驗中，我們利用溫度可控惰性氣體高能球磨機來制備納米級雄黃粉體，采用正交設計實驗方法，對球料比(4：1～16：1)、球磨轉速(23～38Hz)、球磨時間(4～16h)、球磨介質去離子水量(10～150mL)、球磨溫度(-20～10℃)等球磨參數(shù)進行五因素四水平的正交實驗設計。實驗結果表明，制備納米級雄黃的最佳工藝參數(shù)為球料比16：1、球磨轉速38Hz、球磨溫度

4、-20℃、球磨時間12h、去離子水量取50mL。 采用掃描電鏡和原子力顯微鏡對納米雄黃表觀形貌進行直接觀察測定，用激光光散射法對納米雄黃的粒度分布范圍進行分析測定。經(jīng)掃描電鏡、原子力顯微鏡和激光散射顆粒度測定儀的測量，結果表明經(jīng)上述優(yōu)化工藝制備的納米雄黃制劑粒徑在100nm以下的達90％，其中較大顆粒是由粒徑在5～30nm左右的細小晶粒和其周圍的非晶體聚集而成。實驗結果表明，掃描電鏡法、原子力顯微鏡法和激光光散射法快速、簡便、準

5、確，可用于納米雄黃的粒度檢測。 小鼠體內(nèi)藥動學研究結果：納米雄黃中砷在小鼠體內(nèi)的藥動學行為符合開放性血管外給藥一室模型一級速率過程；納米雄黃與傳統(tǒng)水飛雄黃的藥代動力學參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學分析均有顯著差異(P<0.05)；與傳統(tǒng)水飛雄黃相比，納米雄黃中砷達峰時間早、峰濃度高、AUC大，在體內(nèi)吸收快，消除慢，藥物在體內(nèi)維持時間長。 體外活性實驗證明：納米雄黃可明顯誘導腫瘤細胞NB4、HL-60、K562及U937產(chǎn)生凋亡，對U937

6、作用尤為明顯，本文對PI3-K/Akt和SIRT1/p53途徑在納米雄黃粉體誘導U937細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用進行了深入討論。將20，40，60，80或100μg/mL的NRP作用于淋巴瘤U937細胞12，24，36或48小時，通過MTT法檢測到NRP誘導U937細胞的死亡成一定時間和濃度依賴性。熒光顯微鏡下細胞呈明顯的凋亡形態(tài)學特征，細胞膜出泡、細胞核濃縮且有顆粒狀的凋亡小體出現(xiàn)。采用乳酸脫氫酶活力(LDH)實驗，測定凋亡和壞死細

7、胞的比例，20～80μg/mLNRP作用U937細胞24h，凋亡的細胞顯著增加，而壞死的細胞沒有顯著的變化且仍低于10.8％，當NRP的濃度增加至120μg/mL時，凋亡細胞比率開始明顯下降，壞死細胞比率開始明顯增加，結果表明NRP誘導U937細胞的死亡過程是一個介于細胞凋亡與細胞壞死之間的平衡過程。我們采用流式細胞術和Westernblot方法相結合，檢測了PI3-K/Akt途徑對NRP誘導U937細胞凋亡的影響，實驗結果表明PI3-

8、K/Akt途徑對細胞凋亡具有保護作用，而NRP通過抑制PI3-K/Akt途徑的活化從而促進了U937細胞的凋亡。我們采用MTT法和Westernblot方法進一步考察了SIRT1和p53在NRP誘導U937細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用，結果表明NRP活化了p53，而SIRT1的抑制劑sirtinol進一步增強了p53的活化。且Westernblot結果顯示，P13-K的抑制劑wortmannin對SIRT1的表達有明顯的抑制作用，從而增強