鰈形目魚類生長激素基因的克隆及牙鲆生長激素在釀酒酵母中的表達研究.pdf

1、本論文克隆了9種鰈形目魚類的生長激素基因cDNA序列并運用PAUP軟件進行了分子系統(tǒng)進化樹分析，構建了四種不同類型的釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae表達牙鲆生長激素的載體，并研究了牙鲆生長激素基因在釀酒酵母中的表達情況。 從7種重要鰈形目經(jīng)濟魚類——高眼鰈(Cleisthenes herzenstein)、黃蓋鰈(Limanda yokohamae)、木葉鰈(Pleuronichthys Cornutus)

2、、寬體舌鰨(Cynoglossus robustus)、石鰈(Platichthys bicoloratus)和條鰨(Zebrias zebra)、夏鲆(Paralichthysdentatus)的腦垂體中提取mRNA,并采用RT-PCR方法，根據(jù)已克隆得到的鲆鰈魚類生長激素基因的保守性序列設計特異性引物，克隆了含開放閱讀框的生長激素(Growth Hormone，GH)cDNA序列，測序結果顯示，高眼鰈、黃蓋鰈、木葉鰈、寬體舌鰨、石鰈

3、、條鰨和夏鲆的GH cDNA長度依次為479 bp、564 bp、519 bp、440 bp、564 bp、440 bp和522 bp，編碼140-170個氨基酸的成熟GH多肽片段；從漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)腦垂體中提取mRNA，利用SMART-RACE技術建立腦垂體cDNA文庫，并從該文庫中克隆出大菱鲆和漠斑牙鲆生長激素基因cDNA全長序列。測序結

4、果表明，克隆的大菱鲆GH cDNA序列全長為876 bp，包括108 bp的5’UTR和1174 bp的3’UTR序列，開放閱讀框全長591bp，編碼由197氨基酸殘基組成的生長激素成熟肽序列，漠斑牙鲆GH cDNA序列全長為902 bp，包括l31 bp的5’UTR和198 bp的3’UTR序列，開放閱讀框全長570 bp，編碼由190氨基酸殘基組成的生長激素成熟肽序列。運用PAUP軟件對15種鰈形目魚類與另外7種不同種屬魚類進行了分

5、子系統(tǒng)進化樹分析，結果與根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學和生化特征分類進化地位基本一致，在15種鰈形目魚類中只有大菱鲆和塞內(nèi)加爾鰨各自單獨形成一個分支且與鲆科和鰈科魚類相距較遠，其中塞內(nèi)加爾鰨等種類的分類地位與根據(jù)線粒體DNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)生模式基本吻合。說明生長激素基因可以有效地用于研究鰈形目等硬骨囪類的親緣關系及分類地位。 通過將牙鲆生長激素基因，插入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示載體pYD1中，構建

6、了非整合型載體pYD-GH，并在此基礎上構建了三種整合型載體：適合于細胞外誘導表達的pYD-E2、細胞內(nèi)誘導表達的pYD-E4和細胞內(nèi)組成表達的pYD-EP4。將載體轉化至釀酒酵母菌株EBYl00中，得到轉牙鲆生長激素釀酒酵母，對牙鲆生長激素在釀酒酵母中的表達和生物學活性進行了研究。非整合型載體pYD-GH無法在酵母細胞的傳代中穩(wěn)定存在而整合型載體pYD-E2、pYD-E4和pYD-EP4經(jīng)過30代后的陽性檢出率為100％，證明通過同源

7、重組目的基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到酵母基因組。對細胞外誘導表達的pYD-GH和pYD-E2轉化酵母進行熒光標記，熒光顯微鏡和流式細胞儀分析外源基因表達情況，結果顯示半乳糖誘導6小時的轉化酵母即具有最高的熒光強度而12小時的轉化酵母仍具有較高的熒光強度。經(jīng)過計算，牙鲆生長激素在GAL為啟動子的胞外表達工程菌E2中的表達量為1.02‰，在GAL為啟動子的胞內(nèi)表達工程菌E4中的表達量為1.49％0，而以PGK為啟動子的胞內(nèi)表達工程菌EP4的表達量為1

8、.93‰。對表達了牙鲆生長激素的釀酒酵母進行生物活性檢測，發(fā)現(xiàn)E2、E4和EP4在促進牙鲆生長、提高餌料轉化率方面均有顯著的作用，即使添加量僅有0.5％，在7周時間里體重增長分別比商品飼料對照組提高了27.16％、26.76％和31.21％，餌料轉化率比對照組分別提高22.75％、22.34％和26.15％，隨著釀酒酵母添加量的增加，作用更加顯著，當釀酒酵母添加量達到1％，轉基因釀酒酵母(E2、E4、EP4)組魚的體重增長分別比商品飼料

9、對照組提高了47.29％、46.87％和50.24％，餌料轉化率比對照組分別提高30.65％、30.46％和32.07％。最后為評價轉牙鲆生長激素基因酵母的安全性，將轉基因酵母灌胃昆明種小鼠進行急性毒性試驗、傳統(tǒng)致畸試驗、骨髓微核和精子畸形試驗，急性毒性實驗結果顯示轉牙鲆生長激素基因的釀酒酵母對小鼠均不具有毒性(LD50>10g/10/kg)。另外在傳統(tǒng)致畸試驗、骨髓微核和精子畸形試驗和小鼠組織器官影響實驗中三種轉基因釀酒酵母的三個劑量