胸腺免疫抑制五肽TIPP的抗哮喘氣道炎癥作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　哮喘是由多種細胞（包括氣道的炎癥和結(jié)構(gòu)細胞）和炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥是其發(fā)病機制的基礎(chǔ)和核心。哮喘患病率高，在各個年齡階段的人群均可發(fā)病，已成為全球關(guān)注的公眾衛(wèi)生問題。哮喘不能根治，只能通過藥物進行控制?，F(xiàn)在治療哮喘最常用的藥物是糖皮質(zhì)激素，對于嚴重哮喘患者長期吸入激素會產(chǎn)生局部或全身毒副反應(yīng)，因此研究開發(fā)治療效果好、毒副作用小的抗哮喘藥具有重要意義。
　　本項目組長期從事胸腺來源的免疫抑制組

2、分——胸腺免疫抑制提取物(TISE)的研究。TISE是內(nèi)源性的淋巴細胞生長抑制物，在體內(nèi)外均可以有效地抑制免疫反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)。研究表明TISE能顯著抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)，顯著延長大鼠移植皮膚的存活期，并對OVA刺激致敏豚鼠哮喘的發(fā)生有顯著的抑制作用。將低分子量的TISE通過微球菌核酸酶降解、酸水解及反相高效液相色譜分離相結(jié)合的方法進行進一步的分離純化，最終得到一個分子量為604.68 Da的五肽，其序列為Ala-

3、Glu-Trp-Cys-Pro，并將其命名為胸腺免疫抑制五肽(thymic immunosuppressive pentapeptide，TIPP)。鑒于TISE體內(nèi)外均有顯著的抗炎抗變態(tài)反應(yīng)的作用，TIPP是由TISE中分離純化得到的，我們推測TIPP可能也具有抗過敏和抗變態(tài)反應(yīng)炎癥的作用，并能用于哮喘的治療。為證實這個推測，我們首先對TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥活性進行研究，從組織水平、細胞水平、分子水平等各個方面評價TIPP對哮喘動

4、物模型的治療作用及毒副作用;利用體外肥大細胞激活實驗檢測TIPP的體外抗過敏活性及作用機制，結(jié)合蛋白芯片實驗尋找相關(guān)的TIPP作用蛋白;因TIPP是一新發(fā)現(xiàn)的具有全新序列的五肽，對TIPP活性及其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進行初步考察。本研究有可能發(fā)現(xiàn)一個治療過敏性疾病的新機制，并為TIPP這一新的五肽的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)，因此本項目研究具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1.TIPP體外免疫抑制活性及TIPP結(jié)構(gòu)與活性

5、關(guān)系的研究
　　首先用脾淋巴細胞檢測TIPP的細胞毒性、TIPP對不同絲裂原刺激的脾淋巴細胞增殖的抑制作用及TIPP對LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬細胞吞噬活性的影響，并對TIPP與3種衍生物(D-Glu2)-TIPP、[Ala(Ac)1]-TIPP及(Ser4)-TIPP的免疫抑制活性進行比較。
　　2.TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥作用研究
　　采用五周齡雌性BALB/c小鼠于第0、7、14天進行卵清蛋白(OVA

6、)致敏并于第28-33天用OVA經(jīng)鼻刺激，建立小鼠過敏性哮喘模型。于最后一次激發(fā)24 h后，取血測定外周血白細胞(WBC)分型;取血清及肺泡灌洗液(BALF)，測定血清中OVA特異性IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;流式細胞技術(shù)檢測BALF中不同免疫細胞亞型比例的改變;HE及PAS染色檢測小鼠肺部炎癥細胞浸潤及支氣管周杯狀細胞增生情況;實時定量熒光PCR技術(shù)檢測小鼠肺組織中細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平;Weste

7、rn blot方法檢測小鼠肺組織炎癥相關(guān)蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表達水平，并檢測炎癥相關(guān)信號通路蛋白絲裂原激活蛋白激酶MAPKs及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活情況。同時采用豚鼠氣管環(huán)實驗檢測TIPP對組胺、乙酰甲膽堿刺激的氣管平滑肌收縮的影響。
　　3.TIPP體外抗過敏活性及機制研究
　　采用抗原DNP-HSA對anti-DNP-IgE致敏的RBL-2H3細胞進行刺激，檢測TIPP對IgE-抗原復合物刺激的

8、RBL-2H3細胞激活的影響。主要包括:檢測細胞培養(yǎng)上清中β-氨基己糖苷酶活性及組胺含量，分析TIPP對脫顆粒的影響;用Ca2+熒光探針Fluo3-AM檢測TIPP對激活的RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+水平的影響;實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TIPP對IgE介導RBL-2H3細胞激活時相關(guān)炎癥因子mRNA水平的影響;用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架蛋白F-actin，激光共聚焦顯微鏡檢測TIPP對IgE-抗原復合物刺激RBL-2H3細胞激

9、活時膜波動的影響;Western blot方法檢測TIPP對IgE-抗原復合物刺激RBL-2H3細胞激活時COX-2的表達水平、信號通路相關(guān)蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活的影響。
　　4.尋找TIPP靶點
　　采用激光共聚焦顯微鏡觀察TIPP與RBL-2H3細胞的結(jié)合情況，并用流式細胞技術(shù)分析TIPP濃度、作用時間、孵育溫度對TIPP與RBL-2H3細胞的結(jié)合的影響。用生物素標記TIPP，采用HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片

10、檢測與TIPP有相互作用的蛋白質(zhì)，結(jié)合之前實驗結(jié)果，推測TIPP可能作用靶點。并檢測TIPP對K562細胞（Bcr-Abl陽性表達）和HL60細胞（Bcr-Abl陰性表達）增殖的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1.TIPP具有免疫抑制活性且活性與結(jié)構(gòu)相關(guān)
　　TIPP對Con A及LPS刺激的小鼠脾淋巴細胞的增殖均有抑制作用，但對ConA刺激的小鼠脾淋巴T細胞增殖的抑制作用更為顯著，并能抑制因LPS刺激引起的小鼠RAW26

11、4.7細胞的吞噬能力的增強。TIPP對未加絲裂原刺激的小鼠脾淋巴細胞及RAW264.7細胞的細胞生存率沒有影響，即TIPP沒有細胞毒性，其對Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴細胞的增殖及LPS刺激引起的小鼠RAW264.7細胞吞噬能力增強的抑制作用并不是因其毒性作用產(chǎn)生的。TIPP免疫抑制活性的發(fā)揮與其自身的結(jié)構(gòu)相關(guān)，但其Cys4的-SH基團對TIPP抑制活性的發(fā)揮起一定的增強作用。當TIPP的-SH變?yōu)?OH時，其活性降低顯著。

12、>　　2.TIPP能顯著抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生
　　TIPP可以顯著抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生，體內(nèi)給藥毒副作用小。TIPP顯著降低哮喘小鼠BALF中細胞總數(shù)并能有效抑制BALF中不同亞型細胞比例的改變;組織切片分析表明TIPP對哮喘小鼠肺部炎癥細胞浸潤及支氣管周杯狀細胞增生有抑制作用;TIPP可有效抑制哮喘小鼠血清中OVA特異性IgE的水平和BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平，并能顯著抑制肺組織中炎癥

13、因子IL-4、TNF-α及eotaxin-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;Western blot結(jié)果顯示TIPP可有效地抑制哮喘小鼠肺組織炎癥相關(guān)蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表達水平，并能有效抑制炎癥相關(guān)信號通路蛋白MAPKs及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活。豚鼠氣管環(huán)實驗結(jié)果表明，TIPP對乙酰甲膽堿及組胺引起的氣管平滑肌的收縮并沒有直接的抑制作用，即TIPP抗哮喘作用的發(fā)揮并不是直接的支氣管舒張作用，而是依賴于其抗炎活性。

14、　　3.TIPP抑制Raf/MEK/ERK信號通路及NF-κB的核移位
　　TIPP主要作用于抗原刺激階段，可顯著抑制因抗原DNP-HSA刺激的致敏RBL-2H3細胞激活引起的脫顆粒，抑制因抗原刺激導致的RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+水平的增高和膜波動的發(fā)生，對抗原刺激引起的細胞內(nèi)相關(guān)炎癥因子IL-3、IL-4、IL-6、IL-13、TNF-α及MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄有抑制作用，并能抑制COX-2蛋白的表達。Western blo

15、t分析TIPP的作用機制，結(jié)果表明TIPP可顯著抑制Raf/MEK/ERK信號通路及NF-κB的核移位，而對JNK、p38、AKT的激活沒有影響。
　　4.生長因子受體結(jié)合蛋白Grb2是TIPP的可能作用靶點
　　激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TIPP可以與RBL-2H3細胞的細胞膜結(jié)合，并能進入細胞內(nèi);流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TIPP與RBL-2H3細胞的結(jié)合具有濃度、時間、溫度依賴性;HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片檢測發(fā)現(xiàn)TIP

16、P與生長因子受體結(jié)合蛋白Grb2有特異性相互作用，其熒光信號值（扣除背景值后）達1187.500±27.577，信噪比SNR為26.159±0.998。Raf/MEK/ERK是Ras下游信號通路，而Grb2又是Ras激活所需的重要銜接蛋白，因此我們推測TIPP可能是Ras信號通路上游重要銜接蛋白Grb2的阻斷劑，TIPP通過與Grb2蛋白的SH2或SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷其與上游酪氨酸激酶LAT酪氨酸磷酸化位點或與下游SOS蛋白的結(jié)合，阻

17、斷了Ras信號通路的激活，從而發(fā)揮其抗炎抗過敏作用的。此外，與HL60細胞（Bcr-Abl陰性表達）相比，TIPP對Bcr-Abl陽性表達細胞K562增殖的抑制作用更為顯著，能將其阻滯在G2期。TIPP對K562細胞的增殖表現(xiàn)出更明顯的抑制活性，這與TIPP是Grb2阻斷劑這一假設(shè)符合。
　　結(jié)論：
　　(1)首次對胸腺免疫抑制五肽TIPP的免疫抑制活性進行了研究。TIPP對Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴細胞的增殖及LP

18、S刺激的小鼠RAW264.7吞噬能力的增強均有抑制作用，且無細胞毒性。
　　(2)對TIPP活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系進行了初探。TIPP活性的發(fā)揮與其自身的結(jié)構(gòu)相關(guān)，但其Cys4的-SH基團對TIPP抑制活性的發(fā)揮起一定的增強作用。
　　(3)首次對TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥作用進行了研究。TIPP可有效的抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生，且體內(nèi)給藥毒副作用小。
　　(4)首次對TIPP體外抗過敏活性進行了研究。TIPP可以有效地抑制

19、IgE-抗原復合物刺激的RBL-2H3細胞的激活。
　　(5)首次對TIPP作用機制進行了研究。TIPP可以抑制Raf/MEK/ERK信號通路的激活及NF-κB的核移位，抑制IgE-抗原復合物刺激的RBL-2H3細胞的激活。TIPP可能是Grb2的阻斷劑，通過與Grb2蛋白結(jié)合，阻斷了Ras信號通路的激活，從而發(fā)揮其抗炎抗過敏作用的。
　　(6)對TIPP是Grb2阻斷劑這一機制進行初步驗證。與Bcr-Abl陰性表達細胞HL